Analyse der Zusammensetzung und des intrazellulären Transports nativer HCN Kanalkomplexe
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Durch Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid Screens neuronaler und kardialer cDNA-Bibliotheken haben wir neue HCN Kanal Interaktionspartner identifiziert. Das hierbei von uns am intensivsten untersuchte Protein ist das VAMP-assoziierte Protein VAPB. VAPB besitzt eine transmembranäre und zwei intrazelluläre Domänen. VAPB moduliert die Strom-Amplitude von HCN1 und HCN2 Kanälen, während es HCN4 Kanäle nicht beeinflusst. In niedrigen Konzentrationen erhöht VAPB die HCN2 Strom-Amplitude, während es in größeren Konzentrationen die HCN2 Strom-Amplitude verkleinert. Ferner moduliert VAPB den V1/2 der Aktivierung von HCN2 Kanälen. Wir konnten zeigen, dass VAPB mit dem N-Terminus des HCN2 interagiert und dass für die Effekte des VAPB die Transmembran-Domäne von essentieller Bedeutung ist. So bewirkt die Expression der Transmembran-Domäne alleine bereits eine Vergrößerung der HCN2 Ströme. Die Vergrößerung des HCN2 Stroms durch die Transmembran-Domäne oder durch das volle Länge VAPB beruht nicht auf einer erhöhten Oberflächen-Expression des HCN2 Kanals, sondern auf einer erhöhten Leitfähigkeit. Wir konnten ferner zeigen, dass die zuvor beschriebene VAPB Mutation (P56S), die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) verursacht, zum Verlust der Modulation der HCN Kanäle führt. Die Bedeutung der Modulation der HCN Kanäle durch VAPB bei der Entstehung der ALS möchten wir in Zukunft weitergehend untersuchen. Neben VAPB haben wir vier weitere Proteine entdeckt, welche die HCN Stromdichte modulieren. Da diese Projekte aber noch nicht abgeschlossen sind und intensiver Studien auch zur physiologischen Relevanz bedürfen, konnte die Bedeutung dieser Proteine im Rahmen dieser Förderung noch nicht abgeschlossen werden. Wir konnten ferner zeigen, dass die Kaliumkanal-Untereinheit KCNE4 einen hyperpolarisationsaktivierten Strom in Oozyten induzieren kann. KCNE4 ist jedoch keine Untereinheit eines HCN Kanals, sondern induziert einen hyperolarisations-aktivierten Cl- Strom in Xenopus und Ambystoma Oozyten. Die molekulare Identität des KCNE4-induzierten Cl-Stroms bleibt vorerst unklar. Die Permeabilitätsreihe und die Strom-Kinetik sowie die Pharmakologie passen nicht zu den bisher bekannten bzw. klonierten Cl-Kanälen. In Zukunft werden wir versuchen die molekulare Identität des Cl-Kanals zu identifizieren. Wir haben im S5 Segment von HCN Kanälen einen Leuzin-Zipper identifiziert. Mutationen in diesem Leuzin-Zipper bewirken eine Reduktion der HCN Strom-Amplitude, wobei die Strom-Reduktion umso ausgeprägter ist, desto weiter „oben“ im Kanal die Leuzin-Zipper Mutation lokalisiert ist. Diese Veränderungen in der Strom-Amplitude beruhen nicht auf einem Trafficking-Defekt. Die mutierten Kanäle werden effektiv an die Membran transportiert, haben aber ihre Fähigkeit verloren durch Hyperpolarisation zu öffnen. Dieser Verlust der spannungs-abhängigen Aktivierung ist ebenfalls umso ausgeprägter, desto „höher“ die Mutation im S5 Segment des HCN lokalisiert ist. Der untere Teil des Leuzin-Zippers stabilisiert den geschlossenen Zustand des Kanals und ist maßgeblich an der Regulation der Öffnungs-Wahrscheinlichkeit der Kanäle beteiligt. Wir schließen aus unseren Experimenten, dass der Leuzin-Zipper im S5 Segment von HCN Kanälen nicht wie zuerst von uns vermutet als Interaktions-Domäne für akzessorische Proteine dient, sondern eine wichtige molekulare Determinante darstellt für das invertierte Schaltverhalten von HCN Kanälen. Ferner haben wir das Trafficking der Sinus-Bradykardie auslösenden HCN4 Kanal Mutation D553N untersucht. Hierbei haben wir festgestellt, dass der krankheits-auslösende Mechanismus nicht auf einem dominant-negativen Trafficking-Defekt beruht, wie ursprünglich beschrieben. Wir postulieren, einen Gating-Defekt durch eine veränderte Salzbrücke im proximalen C-Terminus des Kanals (C-Linker). Durch die veränderte elektrostatische Interaktion innerhalb des C-Linkers kommt es zu einer verringerten Öffnungs-Wahrscheinlichkeit und einem Verlust der cAMP- Modulation des HCN4 Kanals. Ratten der WAG/Rij Linie zeigen Symptome, die stark Absence-Epilepsien des Menschen ähneln. Wir konnten zeigen, dass Ratten dieser Linie im Thalamus einen HCN1 Kanal mit einer N-terminalen Deletion exprimieren. Der „WAG-HCN1“ Kanal zeigt vergrößerte Strom-Amplituden und bewirkt eine Verschiebung des V1/2 der Aktivierung von heteromeren Kanälen mit HCN2 zu mehr negativen Potentialen. Außerdem bewirkt WAG-HCN1 eine Reduktion der Strom-Amplituden von heteromeren Kanälen mit HCN2 und HCN4. Die Eigenschaften der homomeren und heteromeren WAG-HCN1 Kanäle können sehr gut die früheren Befunde in den Neuronen der WAG/Rij Ratten erklären. Somit spielt die von uns detektierte HCN1 Variante vermutlich eine entscheidende Rolle für die Entstehung der Absence-Epilepsien in der WAG/Rij Linie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- (2010). RNA editing modulates the binding of drugs and highly unsaturated fatty acids to the open pore of Kv potassium channels. EMBO J. 29, 2101-2113
Decher, N., Streit, A.K., Rapedius, M., Netter, M.F., Marzian, S., Ehling, P., Schlichthörl, G., Craan, T., Renigunta, V., Köhler, A., Dodel, R.C., Navarro-Polanco, R.A., Preisig-Müller, R., Klebe, G., Budde, T., Baukrowitz, T., and Daut, J.
- (2011). A specific two-pore domain potassium channel blocker defines the structure of the TASK-1 open pore. J Biol Chem. 286, 13977-13984
Streit, A.K., Netter, M.F., Kempf, F., Walecki, M., Rinné, S., Bollepalli, M.K., Preisig-Müller, R., Renigunta, V., Daut, J., Baukrowitz, T., Sansom, M.S., Stansfeld, P.J., and Decher, N.
- (2011). Knock-Out of the Potassium Channel TASK-1 Leads to a Prolonged QT Interval and a Disturbed QRS Complex. Cell Physiol Biochem. 28, 77-86
Decher, N., Wemhöner, K., Rinné, S., Netter, M.F., Zuzarte, M., Aller, M.I., Kaufmann, S.G., Li, X.T., Meuth, S.G., Daut, J., Sachse, F.B., and Maier, S.K.
- (2011). RNA editing of Kv1.1 channels may account for reduced ictogenic potential of 4-aminopyridine in chronic epileptic rats. Epilepsia. 52, 645-648
Streit, A.K., Derst, C., Wegner, S., Heinemann, U., Zahn, R.K., and Decher, N.
- (2011). TASK-1 channels may modulate action potential duration of human atrial cardiomyocytes. Cell Physiol Biochem. 28, 613-624
Limberg, S.H., Netter, M.F., Rolfes, C., Rinné, S., Schlichthörl, G., Zuzarte, M., Vassiliou, T., Moosdorf, R., Wulf, H., Daut, J., Sachse, F.B., and Decher, N.
- 2011, FB20 Medizin Marburg. „Identifizierung und funktionelle Charakterisierung eines neuen HCN2- Interaktionsproteins“. Dissertation
Magdalena Walecki
- (2012). Altered stress stimulation of inward rectifier potassium channels in Andersen-Tawil syndrome. FASEB J. 26, 513-522
Seebohm, G., Strutz-Seebohm, N., Ursu, O.N., Preisig-Müller, R., Zuzarte, M., Hill, E.V., Kienitz, M.C., Bendahhou, S., Fauler, M., Tapken, D., Decher, N., Collins, A., Jurkat-Rott, K., Steinmeyer, K., Lehmann-Horn, F., Daut, J., Tavare, J.M., Pott, L., Bloch, W., and Lang, F.
(Siehe online unter https://doi.org/10.1096/fj.11-189126)
