Aufbau und Anwendung einer neuartigen nanoLC-CE-MS-Plattform

• Antragsteller: Professor Dr. Christian Neusüß
• Fachliche Zuordnung: Analytische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 465662382

Proteine und deren posttranslationalen Modifikationen (PTMs) spielen eine große Rolle zur Diagnose und möglicher Therapie von zahlreichen Krankheiten. Wegen ihrer niedrigen Konzentration und der großen Variabilität dieser PTMs ist eine direkte Charakterisierung nach wie vor eine große Herausforderung in der Bioanalytik.In diesem Projekt wollen wir eine neuartige zweidimensionale Trenntechnik bestehend aus nano-Flüssigkeitschromatographie und Kapillarelektrophorese in Kopplung mit der Massenspektrometrie (nanoLC-CE-MS) entwickeln, und diese zunächst auf die Analytik von intakten (phosphorylierten) Proteinen in biologischen Proben anwenden. Dabei geht es darum die Vorteile der beiden im wesentlichen orthogonalen Trenntechniken miteinander zu kombinieren: Die Umkehrphasen-Chromatographie ermöglicht einerseits eine Aufkonzentrierung der Analyte und trennt andererseits dann unterschiedliche Proteine. Die Kapillarelektrophorese ist hingegen besonders gut geeignet zur Trennung von Proteoformen, die sich speziell im Hinblick auf die Ladung unterscheiden (z.B. Varianten der Phosphorylierung). Mittels eines isolierten Ventils mit Probenschleifen im mittleren nanoliter-Bereich, welches wir für die CE-CE-Kopplung entwickelt haben, soll die Umkehrphasenchromatographie im nanoliter-Flussbereich (nanoLC) mit der CE gekoppelt werden. Dabei soll zunächst eine solche nanoLC-CE-Anlage aufgebaut werden und wesentliche Parameter für eine erfolgreiche Kopplung bestimmt werden. Dazu soll u.a. die Kompatibilität der Lösungsmittel der beiden Trennsystem, die Übergabevolumina sowie die Kapillarbeschichtung in der CE untersucht werden, um die bestmögliche Trenneffizienz in beiden Trenndimensionen zu erhalten. Neben der Übergabe eines einzelnen Volumens aus der ersten Dimensionen („heart-cut“) ist geplant, die mehrfache Übergabe (multiple heart-cut) sowie das mehrfache Injizieren in die CE ohne dass die Trennung dort beendet ist (Multisegmentinjektion), zu untersuchen, um das Gesamtsystem möglichst effektiv zu betreiben.Zur Identifizierung und vor allem zur Positionsbestimmung von PTMs soll die LC-CE-Trennung mittels nano-Elektrosprayionisierung gekoppelt werden an die Top-down tandem-Massenspektrometrie. Das Gesamtsystem soll dann auf reale Proben angewendet werden und so eine direkte Analyse von Proteoformen intakter Proteine in biologischen Matrizes ermöglichen.In einer anschließenden weiteren Projektphase sollen dann einerseits verschiedene andere chromatographische Trennungen (Ionenchromatographie oder HILIC - „hydrophilic liquid interaction chromatography“), andererseits eine umfassende Trennung (LC X CE) entwickelt werden, sowie klinische Anwendungen angegangen werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen