Das Protein-Protein- Interaktionsnetzwerk von KNL2 in Pflanzen

• Antragstellerin: Dr. Inna Lermontova
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 467635690

• Erstellungsjahr: 2025

Zusammenfassung der Projektergebnisse

KNL2 ist ein zentromerassoziiertes Protein, das als Lizenzierungsfaktor für die Ablagerung von CENH3 und die Assemblierung des Kinetochors dient. In Arabidopsis besitzt αKNL2 eine N-terminale SANTA-Domäne und ein C-terminales CENPC-k-Motiv. Zur Untersuchung seiner molekularen Funktion und Regulation identifizierten wir Interaktionspartner mittels Hefe-Zwei-Hybrid-(Y2H)-Screening sowie Affinitätsreinigung in Kombination mit Massenspektrometrie (AP-MS). Screenings mit der Vollversion, der N-terminalen sowie der C-terminalen Fragmenten von αKNL2 zeigten überlappende Interaktoren. Um zu prüfen, ob pflanzliches KNL2 Komplexe mit Proteinen aus konservierten Signalwegen über Artgrenzen hinweg bildet, führten wir Gen-Ontologie- und Pathway-Enrichment-Analysen der AP-MS- Daten aus Arabidopsis und C. elegans durch. Diese Analysen zeigten eine konservierte Anreicherung posttranslationaler Modifikationswege, insbesondere der Ubiquitinierung und SUMOylierung. Basierend auf diesen Ergebnissen wählten wir Kandidatenproteine wie Ubiquitin-konjugierende Enzyme (UBC19, UBC20), E3-Ligase-Komponenten (APC2, APC10, CDC20) und SUMO-assoziierte Proteine (SUMO3, ULP1D) aus und bestätigten deren Interaktion mit αKNL2 mittels BiFC-, Y2H- und Ko-Immunpräzipitations-Assays. Funktionelle Analysen zeigten, dass αKNL2 polyubiquitiniert wird und über das 26S- Proteasom abgebaut wird. Die Behandlung mit Proteasominhibitoren stabilisierte αKNL2 in planta signifikant. Deletion oder Mutation vorhergesagter Degrons (D-Box1-Motiv) und Ubiquitinierungsstellen führten zu abbaustabilen αKNL2-Varianten, die die Zellzyklusprogression fehlregulierten. Transgene Pflanzen, die diese Varianten exprimierten, zeigten reduziertes Wurzelwachstum und mitotische Defekte wie Metaphasenfehlstellungen und Anaphasebrücken, was die entwicklungsbiologische Relevanz eines gestörten αKNL2- Umsatzes unterstreicht. Die SUMOylierung war ebenfalls entscheidend und regulierte die Lokalisierung von αKNL2 sowie dessen Interaktion mit zentromerischem Chromatin. Mutationen in konservierten SUMOylierungsstellen und im SIM-Motiv beeinträchtigten die Zentromer-Zielsteuerung sowie die Interaktion mit SUMO3, ULP1D und CENH3. Darüber hinaus identifizierte die Transkriptom-Analyse ein natürliches Antisense-Transkript (NDC80as) aus dem NDC80-Lokus, das ein 115 Aminosäuren langes Protein mit Coiled- Coil- und DNA-Bindungsmotiven kodiert. Dieses Protein lokalisierte im Zellkern und an der Zellperipherie; seine Überexpression in Arabidopsis führte zu Entwicklungsdefekten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben der posttranslationalen Kontrolle auch die transkriptionelle Regulation durch NATs zur Funktion des Kinetochors beiträgt. Insgesamt zeigt unsere Studie ein mehrschichtiges Regulationssystem, das Proteinmodifikationen und Antisense-Transkription integriert, um Zentromer- und Kinetochor-Dynamik zu steuern.

Projektbezogene Publikationen (Auswahl)

• A CENH3 mutation promotes meiotic exit and restores fertility in SMG7-deficient Arabidopsis. PLOS Genetics, 17(9), e1009779.
  Capitao, Claudio; Tanasa, Sorin; Fulnecek, Jaroslav; Raxwal, Vivek K.; Akimcheva, Svetlana; Bulankova, Petra; Mikulkova, Pavlina; Crhak Khaitova, Lucie; Kalidass, Manikandan; Lermontova, Inna; Mittelsten Scheid, Ortrun & Riha, Karel
  
• High temperature increases centromere-mediated genome elimination frequency and enhances haploid induction in Arabidopsis. Plant Communications, 4(3), 100507.
  Ahmadli, Ulkar; Kalidass, Manikandan; Khaitova, Lucie Crhak; Fuchs, Joerg; Cuacos, Maria; Demidov, Dmitri; Zuo, Sheng; Pecinkova, Jana; Mascher, Martin; Ingouff, Mathieu; Heckmann, Stefan; Houben, Andreas; Riha, Karel & Lermontova, Inna
  
• The role of centromeric repeats and transcripts in kinetochore assembly and function. The Plant Journal, 118(4), 982-996.
  Ramakrishnan Chandra, Jothipriya; Kalidass, Manikandan; Demidov, Dmitri; Dabravolski, Siarhei A. & Lermontova, Inna
  
• Centromeric localization of αKNL2 and CENP-C proteins in plants depends on their centromere-targeting domain and DNA-binding regions. Nucleic Acids Research, 53(4).
  Yalagapati, Surya Prakash; Ahmadli, Ulkar; Sinha, Aditya; Kalidass, Manikandan; Dabravolski, Siarhei; Zuo, Sheng; Yadala, Ramakrishna; Rutten, Twan; Talbert, Paul; Berr, Alexandre & Lermontova, Inna
  
• Heat stress impairs centromere structure and segregation of meiotic chromosomes in Arabidopsis. eLife, 12.
  Crhak Khaitova, Lucie; Mikulkova, Pavlina; Pecinkova, Jana; Kalidass, Manikandan; Heckmann, Stefan; Lermontova, Inna & Riha, Karel
  
• Ubiquitin-dependent proteolysis of KNL2 driven by APC/CCDC20 is critical for centromere integrity and mitotic fidelity. The Plant Cell, 37(7).
  Kalidass, Manikandan; Jarubula, Venkata Ganesh; Ratnikava, Maryia; Chandra, Jothipriya Ramakrishnan; Le Goff, Samuel; Probst, Aline V.; Esposito, Silvia; Grasser, Klaus D.; Bruckmann, Astrid; Gagneux, Jérôme F.; Prosée, Reinier F.; Rutten, Twan; Schubert, Veit; Demidov, Dmitri; Lechner, Esther; Steiner, Florian A.; Genschik, Pascal & Lermontova, Inna