Entwicklung einer Stabilisotopenverdünnungsanalyse für Vitamere der B12-Gruppe nach Biosynthese stabilisotopenmarkierter Isotopologer

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Matthias A. Ehrmann; Professor Dr. Michael Rychlik
• Fachliche Zuordnung: Lebensmittelchemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 467842494

Vitamin B12 oder Cobalamin ist das Vitamin mit der kompliziertesten chemischen Struktur und besteht aus einem zentralen Kobaltatom, das mit einem tetracyclischen Corrinsystem, einem oberen Liganden (Cyanid, Methyl, Hydroxyl oder Adenosyl) sowie 5,6-Dimethylbenzimidazol als unterem Liganden koordiniert ist. Ernährungsphysiologisch ist Vitamin B12 eines der kritischsten Vitamine, da es natürlicherweise nur von bestimmten Bakterien erzeugt wird. Aufgrund seiner Anreicherung in der Nahrungskette werden tierische Lebensmittel (d.h. Fleisch, Milch, Eier, Fisch) und fermentierte Lebensmittel als Quellen für Vitamin B12 angesehen, pflanzliche Lebensmittel jedoch nicht. Daher kommt ein B12-Mangel häufig weltweit vor und im Besonderen bei Veganern und älteren Personen. Um diesem Mangel vorbeugen zu können, ist die Kenntnis über B12-Gehalte in Lebensmitteln essenziell. Die Analytik von B12 ist jedoch eine Herausforderung aufgrund (a) geringer Gehalte in nichtangereicherten Lebensmitteln, wobei die Gehalte der natürlichen Vitamere sogar noch niedriger sind, und (b) der chemischen Labilität der Cobalamine, die zu Abbau der Vitameren und Umwandlungen untereinander führt. Die übliche B12 Analyse basiert entweder auf mikrobiologischen Verfahren oder HPLC-UV nach Überführung aller Cobalamine in Cyanocobalamin. Diese Verfahren zeigen aber entweder eingeschränkte Spezifität oder Sensitivität, und sie liefern keine Information über die natürliche Verteilung der B12-Vitamere, die unterschiedliche Stabilitäten und damit möglicherweise unterschiedliche Bioverfügbarkeiten aufweisen. Daher zielt der vorgelegte Antrag darauf ab, ein auf der LC-MS/MS basiertes Verfahren unter Einsatz von stabilen Isotopologen der natürlichen B12 Vitamere als interne Standards zu entwickeln. Wie wir bereits für die Vitamingruppen der Folate, Pantothensäure und für Pyridoxin zeigen konnten, weisen solche Stabilisotopenverdünnungsanalysen oft eine überlegene Qualität auf. Die stabilisotopenmarkierten Verbindungen werden in unserem Projekt biosynthetisiert, indem Propionibacterium freudenreichii auf N-15 markiertem Ammoniumsulfat als einziger Stickstoffquelle kultiviert wird. Die biosynthetisierten Verbindungen werden durch chromatografische Methoden aufgereinigt und mittels spektrometrischer Methoden voll charakterisiert. In ähnlicher Weise werden Pseudoformen von B12 mit unterschiedlichen unteren Liganden (sog. Cobamide) durch Acidipropionibacterium acidipropionici erzeugt. Diese Substanzen werden anschließend eingesetzt, um eine LC-MS/MS-Methode für natürliche Formen von Cobalamin sowie deren Pseudoformen zu optimieren und zu validieren. Außerdem wird ein Methodenvergleich mit der Standard-Cyanocobalamin-Methode durchgeführt. Schließlich wird die entwickelte Methode auf Lebensmittel und Supplemente angewendet, die reich an Vitamin B12 oder anderen Cobamiden sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen