Entwicklung einer Stabilisotopenverdünnungsanalyse für Vitamere der B12-Gruppe nach Biosynthese stabilisotopenmarkierter Isotopologer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Vitamin B12 oder Cobalamin ist das Vitamin mit der kompliziertesten chemischen Struktur und besteht aus einem zentralen Kobaltatom, das mit einem tetracyclischen Corrinsystem, einem oberen Liganden (Cyanid, Methyl, Hydroxyl oder Adenosyl) sowie 5,6- Dimethylbenzimidazol als unterem Liganden koordiniert ist. Ernährungsphysiologisch ist Vitamin B12 eines der kritischsten Vitamine, da es natürlicherweise nur von bestimmten Bakterien erzeugt wird. Aufgrund seiner Anreicherung in der Nahrungskette werden tierische Lebensmittel (d.h. Fleisch, Milch, Eier, Fisch) und fermentierte Lebensmittel als Quellen für Vitamin B12 angesehen, pflanzliche Lebensmittel jedoch nicht. Daher kommt ein B12-Mangel häufig weltweit vor und im Besonderen bei Veganern und älteren Personen. Um diesem Mangel vorbeugen zu können, ist die Kenntnis über B12-Gehalte in Lebensmitteln essenziell. Die Analytik von B12 ist jedoch eine Herausforderung aufgrund (a) geringer Gehalte in nichtangereicherten Lebensmitteln, wobei die Gehalte der natürlichen Vitamere sogar noch niedriger sind, und (b) der chemischen Labilität der Cobalamine, die zu Abbau der Vitameren und Umwandlungen untereinander führt. Die übliche B12 Analyse basiert entweder auf mikrobiologischen Verfahren oder HPLC-UV nach Überführung aller Cobalamine in Cyanocobalamin. Diese Verfahren liefern aber keine Information über die natürliche Verteilung der B12-Vitamere, die möglicherweise unterschiedliche Bioverfügbarkeiten aufweisen. Daher haben wir ein auf der LC-MS/MS basiertes Verfahren unter Einsatz von stabilen Isotopologen der natürlichen B12 Vitamere als interne Standards entwickelt. Die stabilisotopenmarkierten Verbindungen wurden in unserem Projekt biosynthetisiert, indem Propionibacterium freudenreichii auf N-15 markiertem Ammoniumsulfat als einziger Stickstoffquelle kultiviert wurde. Die biosynthetisierten Verbindungen wurden durch chromatografische Methoden aufgereinigt und mittels spektrometrischer Methoden voll charakterisiert. Diese Substanzen wurden anschließend eingesetzt, um eine LC-MS/MS-Methode für natürliche Formen von Cobalamin zu optimieren und zu validieren. Der Methodenvergleich mit der Standard-Cyanocobalamin-Methode ergab, dass die Cyanidierung nicht vollständig und reproduzierbar in allen Matrizes erfolgt wie bisher angenommen. Daher müssen die Verlässlichkeit der auf diesem Verfahren basierenden Gehaltsdaten in Frage gestellt werden. Schließlich wurde die entwickelte Methode auf Fleisch und andere Lebensmittel angewendet, die Vitamin B12 enthalten. Dabei zeigte sich Fleisch von Wiederkäuern wie Schaf oder Rind als beste B12-Quelle, daneben wurden die Vitamere auch in Algensupplementen (Chlorella) und verschiedenen Milchsorten gemessen. Die neu entwickelte Methode wurde auch angewandt, um das Potenzial von Milchsäurebakterien zur Synthese von B12 zu untersuchen, da mit Milchsäurebakterien fermentierte Lebensmittel ebenfalls potenzielle B12-Lieferanten sein könnten. Während ein mikrobiologischer Test für viele Stämme die Fähigkeit zur Produktion von B12 nachwies, zeigte die spezifischere LC-MS/MS, dass hauptsächlich Pseudovitamin B12 zusammen mit einigen anderen Cobamiden, die andere niedere Liganden enthalten, gebildet wird.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Development of Stable Isotope Dilution Assays for the Analysis of Natural Forms of Vitamin B12 in Meat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 69(36), 10722-10730.
Wang, Mengle; Asam, Stefan; Chen, Jianqi & Rychlik, Michael
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Production of Four 15N-Labelled Cobalamins via Biosynthesis Using Propionibacterium freudenreichii. Frontiers in Microbiology, 12.
Wang, Mengle; Asam, Stefan; Chen, Jianqi; Ehrmann, Matthias & Rychlik, Michael
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Challenges in the determination of total vitamin B12 by cyanidation conversion: insights from stable isotope dilution assays. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 415(23), 5797-5807.
Wang, Mengle; Schuster, Kathrin; Asam, Stefan & Rychlik, Michael
