Prävalenz, Bildung und Funktion von "fremden" CRISPR-RNAs ausgehend vom “extra repeat” von CRISPR-Arrays

• Antragsteller: Professor Dr. Chase Beisel; Zasha Weinberg, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen ; Bioinformatik und Theoretische Biologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 468749960

CRISPR-Cas-Systeme in Bakterien und Archaeen sorgen für eine adaptive Immunität gegen fremde Plasmide und Phagen. Als Teil der adaptiven Immunität werden kleine Fragmente des genetischen Materials eines Eindringlings innerhalb eines CRISPR-Arrays als Spacer gespeichert, die jeweils zwischen festgelegten Wiederholungen liegen. Aus jedem Spacer-Wiederholungspaar entsteht eine CRISPR-RNA (crRNA), die die Effektornuklease des Systems anweist, die zum Spacer passenden Nukleinsäuresequenzen zu suchen und zu zerschneiden. Da dieser Spacer von einem Eindringling stammt, trägt die crRNA dazu bei, eine Resistenz gegen diesen Eindringling zu verleihen, falls er in Zukunft wieder auftaucht.Jeder CRISPR-Array, der einen Satz erworbener Spacer besitzt, beginnt und endet mit einer Repeat-Sequenz, wobei ein Repeat ohne einen zugehörigen Spacer übrig bleibt. Während der zusätzliche Repeat oft notwendig ist, um neue Spacer zu akquirieren, würde dieser auch zu einer crRNA führen, deren Spacer von außerhalb des CRISPR-Arrays stammt. Diese "fremde" crRNA (ecrRNA) wäre von der adaptiven Immunität abgekoppelt, da der Spacer-Abschnitt nicht von einem Eindringling stammt, und sie könnte die crRNA-Biogenese stören. Dementsprechend haben wir kürzlich verschiedene Mechanismen entdeckt, mit denen CRISPR-Cas-Systeme die Bildung von ecrRNAs blockieren. Wir haben jedoch auch Fälle beobachtet, in denen diese Mechanismen nicht vorhanden waren, sodass eine natürliche ecrRNA-Bildung möglich war. Diese Beobachtungen lassen die Vermutung zu, dass die gebildeten ecrRNAs funktionell sind und Effektornukleasen für biologische Anwendungen sind, die über die adaptive Immunität hinausgehen. In diesem Projekt werden wir die Tendenz von CRISPR-Cas-Systemen untersuchen, ecrRNAs zu erzeugen und somit das Genom durch die Effektor-Nuklease direkt anzusteuern. Unsere Hypothese ist, dass funktionelle ecrRNAs durch verschiedene Typen von CRISPR-Cas-Systemen generiert werden können. Um diese Hypothese zu untersuchen, werden wir drei CRISPR-Subtypen (II-A, V-A, VI-B) untersuchen, bei denen wir einen unterschiedlichen Mechanismus zur Blockierung der ecrRNA-Bildung aufgeklärt haben, wobei jedem Subtyp ein Ziel gewidmet ist. Wir werden komplementäre bioinformatische und experimentelle Ansätze anwenden, um das Ausmaß der ecrRNA-Bildung zu bestimmen und um festzustellen, ob die resultierenden RNAs das Targeting durch die Effektor-Nuklease steuern. Die vorgeschlagene Arbeit stellt eine laufende Zusammenarbeit zwischen den Gruppen Weinberg und Beisel dar und kombiniert deren jeweilige Expertise in der bioinformatischen Vorhersage funktioneller RNAs und der experimentellen Untersuchung besagter Systeme. Bei Erfolg des Projekts, wird es die ecrRNA als eine neuartige Klasse von CRISPR-assoziierten RNAs etablieren und neue Wege aufzeigen, durch die CRISPR-Cas-Systeme Funktionen jenseits der adaptiven Immunität ausüben können.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2141: Weitaus mehr als nur Verteidigung: die vielen verschiedenen Funktionen des CRISPR-Cas Systems