Dihydrodipicolinat-Synthase-Superfamilie - zur Entstehung der 5-Keto-4-Deoxyglucarat-Dehydratase und der 2-Keto-3-Deoxy-L-Arabinonat-Dehydratase

• Antragsteller: Professor Dr. Volker Sieber
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 469128000

Das Enzym 5-Keto-4-Desoxyglucarat-Dehydratase (5-KdgD) katalysiert die Dehydratisierung von 5-KDG, gefolgt von einer vinylogenen Decarboxylierung unter Bildung von 2-Ketoglutarat-Semialdehyd (KGSA). 2-Keto-3-desoxy-L-arabinonat-Dehydratase (L-KdaD) katalysiert die Dehydratisierung von L-KDA zum gleichen Produkt KGSA. Beide Enzyme gehören zur Dihydrodipicolinat-Synthase-Superfamilie (DHDPS), deren Vertreter eine TIM-barrel Faltung aufweisen. In mechanistischen Studien wurde die Hypothese aufgestellt, dass die beiden Dehydratasen die ersten gemeinsamen Schritte der Reaktion teilen. Unsere vorläufige Studie zeigte jedoch, dass die jeweiligen Enzyme keine Aktivität gegenüber dem jeweils anderen Substrat besitzen, d.h. 5-KdgD nicht gegenüber L-KDA und L-KdaD nicht gegenüber 5-KDG. Die phylogenetische Analyse der DHDPS-Superfamilie zeigt, dass diese beiden Dehydratasen evolutionär verwandt sind. Daher ist es von wissenschaftlichem Interesse, zu bestimmen, zu welchem Zeitpunkt die gemeinsamen Vorfahren dieser beiden Dehydratasen sich auseinander entwickelt und ihre jeweilige Spezifität erhalten haben. Wir schlagen einen "vertikalen Ansatz" vor, um die wahrscheinlichsten Vorfahren mit Hilfe von „Ahnensequenz“-Rekonstruktionen (Ancestral Sequence Reconstruction, ASR) zu berechnen. Die vorhergesagten „Vorfahren“ werden im Labor mittels Gensynthese „wiederbelebt“. Daneben werden wir uns der Hypothese auch dadurch nähern, dass wir Varianten jeder Dehydratase rational entwerfen, um die Substratspezifität ineinander umzuwandeln. Dieser Ansatz zielt darauf ab, Schlüsselpositionen und die dort notwendigen bzw. erlaubten Aminosäuren zu identifizieren, die für die strikte Substratspezifität wesentlich sind. Die durch rationales Design erhaltenen Substitutionen werden mit den vorhergesagten gemeinsamen „Vorfahren“ vor der Gensynthese verglichen. Darüber hinaus werden wir alle erzeugten Varianten testen, um Varianten zu finden, die 5-KDG ohne gleichzeitige Decarboxylierung dehydratisieren, um 2,5-Dioxoadipinsäure (DOA) zu erhalten. Die Sequenz der Varianten soll helfen, heut vorhandene „zeitgenössische“ Homologe der nicht-decarboxylierenden 5-KdgD zu finden. Dadurch würde auch Zugang zum anderweitig nur aufwändig zu synthetisierenden DOA geschaffen, was weitere Untersuchungen dieser Verbindung erlaubt. Die Kombination von rationalem Design und ASR ist ein Ansatz, der zukünftige Studien zur evolutionären Verwandtschaft von Proteinfamilien unterstützen kann.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Australien
• Kooperationspartner: Professor Mikael Bodén; Professor Dr. Luke Guddat