Cas-13 vermittelter DMPK-Knockdown als neuer Behandlungsansatz für myotone Dystrophie Typ 1

• Antragsteller: Dr. Peter Meinke
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 470092532

Myotone Dystrophie (DM) ist eine Multisystemerkrankung bei der Myotonie und Muskeldystrophie besonders ausgeprägt sind. Das macht DM zur häufigsten Muskeldystrophie im Erwachsenenalter. DM1 wird durch CTG-Repeat Verlängerungen in der 3‘ UTR des DMPK-Gens verursacht. Mutante RNA (welche die verlängerten Repeats enthält) bildet sogenannte „Haarnadel“-Strukturen, welche zu einer verstärkten Interaktion und Anreicherung verschiedener RNA-bindender Proteine in Foci führen. Als Resultat sind mehrere molekulare Pathways (u.A. alternatives Splicing und Polyadenylierung, Transkriptionsregulation, Translation, miRNA-Regulation, und repeat-assoziierte nicht-ATG Translation) pathologisch betroffen. Verschiedene Therapieansätze wurden bereits getestet, allerdings aufgrund verschiedener Ursachen (z.B. unzureichende Bioverteilung, verringerter Abbau der toxischen RNA, Off-Target Effekte) nicht zu einer Therapie entwickelt. Um diese Probleme zu überwinden plane ich die Nutzung der Caspase 13 (Cas-13) für den Knockdown von DMPK-Transkripten. Das kürzlich beschriebene Cas-13 Enzym kann spezifisch RNA binden und diese zerschneiden, was zu einer hohen Knockdown Effizienz führt. Die Verwendung von Cas-13 verspricht eine höhere Spezifität und Effizienz des DMPK-Knockdowns als die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden. Meine ersten Versuche zeigen in der Tat einen sehr effektiven DMPK-Knockdown und einen damit einhergehenden Verlust die erkrankungsspezifischen Foci in Zellkultur. Um das Problem der unzureichenden Bioverteilung zu beheben, plane ich Adeno-assoziierte Viren (AAV) für das Gewebe-Targeting zu verwenden. AAVs sind nicht integrierend, nicht pathogen, und werden bereits erfolgreich für die Behandlung verschiedener Erkrankungen genutzt. Spezifisch plane ich verschiedene guide-RNAs zu testen um (i) einen optimalen DMPK-Knockdown und (ii) einen Isoform-spezifischen Knockdown zu erreichen. Letzteres würde eine Expression von funktionellem DMPK bei gleichzeitiger Eliminierung der krankheitsverursachenden RNA ermöglichen. Das ist von Interesse da noch nicht abschließend geklärt werden konnte, ob humanes DMPK entbehrlich ist. Ich werde die Effekte der verschiedenen guide-RNAs auf die molekulare Pathologie mittels verschiedener etablierter Readouts und Methoden zunächst in Zellkultur testen. Die besten guide RNAs werden in einem etablierten Mausmodell für DM1 auf ihre Effizienz getestet. Dieser Ansatz hat das Potential direkt zu einer Therapie für DM1 entwickelt zu werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen