Assembly und Struktur nativer PMCA-Neuroplastin/Basigin-Komplexe

• Antragsteller: Professor Dr. Bernd Fakler; Professor Dr. Stefan Raunser
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Strukturbiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 471796820

Die dynamische Änderungen der intrazellulären Kalzium (Ca2+) Konzentration, häufig auch als Ca2+-vermittelte Signalübertragung bezeichnet, wird in den meisten (wenn nicht allen) Zellen dazu benutzt, eine Vielzahl von Prozesse und Reaktionskaskaden zu steuern von der Transmitterfreisetzung und Regulation von Enzymaktivitäten bis hin zu Erregungs-Kontraktionskoppelung, zellulären Bewegung und Wachstum. Alle diese Prozesse werden durch den Einstrom von Ca2+ ins Zytoplasma angestoßen und durch Ca2+-Transport aus dem Zytoplasma beendet. Letzteres erfolgt insbesondere durch ATPasen (oder Pumpen), die im Sarco-/Endoplasmatischen Reticulum (SERCA) oder in der Plasmamembran (PMCA) lokalisiert sind. In jüngsten Proteomanalysen konnten wir zeigen, dass die Ca2+-Pumpen der Plasmamembran aller Zellen heteromere Komplexe sind, aufgebaut aus ATPase-Untereinheiten (PMCAs1-4) und zwei bislang unbekannten Membranproteinen, Neuroplastin (NPTN) und Basigin (BASI). Die Bindung der beiden letztgenannte Proteine an die PMCA-Untereinheiten ist für Stabilität und Transport der Komplexe an die Zellmembran zwingend erforderlich, ebenso wie für den effizienten Transport von Ca2+. Insbesondere erhöht die Bindung von NPTN und BASI die Transportgeschwindigkeit und ermöglicht ein ‘Ca2+-clearing‘ im Bereich weniger 10 Millisekunden, anstelle von Sekunden, wie lange Zeit angenommen. Die strukturellen Grundlagen der Assemblierung der PMCA Proteine mit NPTN und BASI sind allerdings ebenso unbekannt, wie die Interaktionspartner der PMCA-NPTN/BASI Kernkomplexe in verschiedenen nativen Geweben. Dieser Antrag verfolgt ein umfassendes Verständnis des Zusammenbaus und der Struktur von PMCA-Neuroplastin/Basigin Komplexen, sowie ihrer ‘molekularen Expression/Erscheinung‘ in nativen Geweben. Zu diesem Zweck werden wir die nachfolgenden Arbeiten und experimentellen Ansätze durchführen: (1) Darstellung der 3D-Struktur von PMCA2-Neuroplastin und PMCA4-Basigin Komplexen, sowie von PMCA2 ohne Hilfsuntereinheiten mittels Kryo-EM (Aim1A), (2) Messung des ATP-Verbrauchs in den (für die Strukturbestimmungen) aufgereinigten PMCA-NPTN/BASI Komplexen mithilfe eines neuen Massenspektrometrie-basierten Aktivitätsassays (Aim1B) und (3) Darstellung des Interaktoms nativer PMCA-Komplexe (Aim2)

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen