Entwicklung einer online-Messtechnik in Mikrotiterplatten für rekombinante Proteine mit kurzen Tags

• Antragsteller: Professor Dr. Stefan Barth; Professor Dr.-Ing. Jochen Büchs
• Fachliche Zuordnung: Bioverfahrenstechnik
• Förderung: Förderung von 2007 bis 2012
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 47386860

Die Generierung neuer Zielproteine durch die molekulare Biotechnologie hat zu einem riesigen Bedarf an effizienten und hochdurchsatzfähigen Screening-Verfahren geführt. In diesem Zusammenhang stellen Mikrotiterplatten (MTPs) einen hervorragenden Mikrobioreaktorarray zur Kultivierung von Mikroorganismen aller Art dar. Mittlerweile sind durch die verfahrenstechnische Charakterisierung vieler Mikroreaktorsysteme die Grundlagen für das Scale-Up in den herkömmlichen Labormaßstab gelegt. Um die Möglichkeiten des Mikromaßstabs effizient einzusetzen und rationale Entscheidungen aus den vielen parallelen Experimenten abzuleiten, ist es unumgänglich kinetische Daten wie Biomassen- und Wertproduktkonzentration aus den Mikrokulturen zu erlangen. Als Ausgangspunkt für das Forschungsvorhaben dient die am Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik entwickelte Technologie zur optischen, nicht invasiven online-Verfolgung von geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Diese Technologie ermöglicht neben der Messung der Biomasse die Konzentrationsmessung des Wertproduktes (im Folgenden: „Zielproteins"), welches mit GFP (Grün Fluoreszierendes Protein) fusioniert wird. Allerdings ist die Fusion eines Zielproteins mit GFP in sehr vielen Fällen nicht möglich.Mit diesem Projekt soll ein universeller optischer online Nachweis von Zielproteinen ohne Fusion mit GFP ermöglicht werden. Zu diesem Zweck sollen sezernierte Proteine mit Hilfe kurzer Tags (in der Größenordnung eines His-Tag) an den Mikroreaktorboden gebunden und dort delektiert werden. Zum einen werden zur Zielprotein-Erfassung optisch aktive Tags verwendet, welche fluoreszierende Aminosäuren, wie Tryptophan und Tyrosin enthalten (im Folgenden „PolyTrp-Tag"). Dabei soll erstmals untersucht werden, wie selektiv die Fluoreszenz eines solchen Tags (in Abhängigkeit von seiner Zusammensetzung) gegenüber dem Flüssigkeitshintergrund detektiert werden kann. Zum anderen werden die Tags verwendet, um das Zielprotein am MTP-Boden selektiv anzureichern und dort mit fokussierender Optik zu erfassen. Verschiedene Anreicherungsprinzipien, wie Affinität zu Nickel-Ionen sowie Volllängenantikörpern (,AK") oder rekombinanten einzelsträngigen Antikörperfragmenten („scFv") werden eingesetzt und hinsichtlich ihrer Selektivität und Praktikabilität verglichen. Mit einer direkten und universellen online- Erfassung von Biomasse- und Zielproteinkonzentration besitzt die zu entwickelnde Technologie das Potential erstmals wichtige Informationen über das Wachstum sowie Proteinexpression mikrobieller Kulturen im ^-Maßstab zu liefern. Zukünftig soll die Proteinexpression in unterschiedlichen Stämmen auf verschiedenen Medien hochparallel untersucht werden. Die neu gewonnenen Informationen sollen eine Grundlage für eine rationale und effiziente Auswahl geeigneter Produktionsstämme bzw. Medien schaffen.Als biologisches Modellsystem (Mikroorganismus & Zielprotein) wird die Expression von Pankreaskarzinom- spezifischen einzelsträngigen rekombinanten Antikörperfragmenten (scFv) in E. coli gewählt. Die Expression und Sezernierung von kleinen Proteinen wie scFv in den E. coli- Kulturiiberstand ist in der Gruppe Barth bereits etabliert. Damit lässt sich der Aufwand bei der Expression des Zielproteins mit unterschiedlichen Tags, aber auch entsprechender Tagspezifischer scFv, welche auf dem MTP-Boden immobilisiert werden, bewältigen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen