Characterization of periplasmic components of the type III secretion system from Xanthomonas

• Antragstellerin: Professorin Dr. Daniela Büttner
• Fachliche Zuordnung: Organismische Interaktionen, chemische Ökologie und Mikrobiome pflanzlicher Systeme ; Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2007 bis 2017
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 48288649

Das Gram-negative pflanzenpathogene Bakterium Xanthomonas campestris pv. vesicatoria transloziert Effektorproteine mit Hilfe eines Typ III-Sekretionssystems (T3S-Systems) in pflanzliche Zellen. Das T3S-System ist eine hoch-komplexe Nanomaschine, die mit einem extrazellulären Pilus sowie einem vorhergesagtem kanalähnlichen Translokon in der pflanzlichen Plasmamembran assoziiert ist. Die Typ III-abhänigige Proteinsekretion wird entscheidend durch das frühe T3S-Substrat HrpB2 bestimmt, welches essential für die Pilusbildung ist. HrpB2 interagiert mit dem mit der inneren Membran assoziierten HrcD-Protein sowie mit dem putativen Peptidoglycan-bindenden HrpB1-Protein. Die Ergebnisse von Proteinanalysen deuten darauf hin, dass HrpB1 und HrpB2 Proteinkomplexe bilden und im Periplasma sowie an der äußeren Membran lokalisiert sind. Interessanterweise ist die periplasmatische Lokalisierung von HrpB2 unabhängig vom T3S-System und wird daher vermutlich durch ein alternatives Transportsystem vermittelt. Ziel des vorliegenden Projektantrages ist die Analyse der periplasmatischen Lokalisierung und Komplexbildung von HrpB1 und HrpB2 sowie die funktionelle Charakterisierung beider Proteine. Interaktionsstudien und Mutantenanalysen sollen zur Identifizierung von HrpB1- und HrpB2-Interaktionspartnern führen sowie zur Lokalisierung funktionell wichtiger Proteinregionen. In einem zweiten Teil des Projektes soll der Beitrag des T3S- und vorhergesagten Sec-Signals von HrpB2 zur periplasmatischen Lokalisierung des Proteins analysiert werden. Desweiteren soll eine potentielle Beteiligung der putativen ATPase SecA des Sec-Systems am Transport von HrpB2 in das Periplasma untersucht werden. Die geplanten experimentellen Ansätze in diesem Projekt sehen Mutagenese-Experimente, in vitro- und in vivo-Interaktions- sowie Infektionsexperimente vor, die in meiner Arbeitsgruppe etabliert sind. Für die Generierung von Expressionskonstrukten werden wir die kosten- und zeit-effiziente Golden Gate-Klonierungsmethode verwenden. Entsprechende Zielvektoren, die die Expression von Genen in Fusion mit einer Epitop-kodierenden Sequenz unter Kontrolle verschiedener Promotoren ermöglichen, stehen bereits zur Verfügung. Die geplanten elektronenmikroskopischen Arbeiten sowie die biochemischen Ansätze zur Proteinkomplexbestimmung sollen in Kooperation mit anderen Abteilungen der Universität durchgeführt werden. Da membran-assoziierte Substrukturen des T3S-Systems in pflanzenpathogenen Bakterien bislang noch nicht analysiert sind, werden die zu erwartenden wissenschaftlichen Ergebnisse signifikant zum Verständnis der Assemblierung und Architektur dieses wichtigen Proteintransportapparates beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Beteiligte Person: Dr. Gerd Hause