Identification and characterisation of the currently unknown gene for human carnosine synthetase (EC 6.3.2.11) upon purification of the homologous enzyme from Gallus gallus
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Ziel der Studie war die Identifizierung des bislang unbekannten Gens für die humane Carnosin-Synthetase (EC 6.3.2.11) u.a. zur Untersuchung des Carnosinstoffwechsels bei diabetischer Nephropathie. Die physiologische Funktion des Dipeptids Carnosin (β-Alanyl-L-Histidin), das in hohen Konzentrationen (bis zu 20 mM) im Skelettmuskel (u.a.) des Menschen vorkommt, ist noch unklar. Die biochemische Charakterisierung des dazugehörigen Enzyms sollte dazu beitragen die Aufgabe des Carnosins besser verstehen zu lernen. Im Vorfeld der Untersuchungen konnten wir zeigen, dass eine Variante des Carnosinabbauenden Enzyms Serum-Carnosinase (EC 3.4.13.20) mit einem Schutz vor diabetischer Nephropathie assoziiert ist. Die biologische Grundlage dieses Effekts ist nicht bekannt. Bisher wurde nur eine Methode zur homogenen Darstellung einer Carnosin-Synthetase (aus dem Hühnchen Gallus gallus) publiziert. Sequenzinformationen sind aus dieser Arbeit nicht bekannt geworden. Für weitergehende Analysen sollte daher zunächst das entsprechende humane Gen identifiziert werden. Es zeigte sich jedoch, dass das Enzym aus dem Brustmuskel von Gallus gallus instabil ist und schwer zu handhaben war. Das Enzym konnte zwar im Rohextrakt verschiedener Gewebe nachgewiesen werden, die Anreicherung mittels chromatographischer Verfahren gelang jedoch nicht. Unser neuer nicht-radioaktiver Enzymtest wurde im Rahmen der Arbeit weiter verbessert und ist möglicherweise für zukünftige biochemische Analysen wertvoll. Weder mit diesem noch mit einem klassischen radioaktiven Test konnten wir das Enzym jedoch reinigen. Die Expression verschiedener Kandidatengene in Escherichia coli und Pichia pastoris gelang, jedoch wies keines der Genprodukte die gesuchte Aktivität auf. Im Verlauf unserer Arbeiten wurde eine Arbeit publiziert, die die partielle Reinigung des Enzyms aus G. gallus beschreibt. Die entsprechende Präparation war stark mit einem Hitzeschockprotein (Hsp90) verunreinigt, die Zuordnung zum entsprechenden Carnosin-Synthetase Gen gelang den Autoren daher zunächst nicht. Erst die Feststellung, dass die heterogene Carnosin-Synthetase-Fraktion wahrscheinlich eine ADP-bildende L-Histidin:β-Alanin Ligase ist, gab den Hinweis auf eine Synthase der „ADP-grasp“-Superfamilie. Tatsächlich konnte nach Ergänzung der Datenbank ein solches Enzym mittels massenspektrometrischer Analysen in der heterogenen Fraktion entdeckt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Relevance of allosteric conformations and homocarnosine concentration on carnosinase activity. Amino Acids. 2010 38(5):1607-15
Peters V, Kebbewar M, Jansen EW, Jakobs C, Riedl E, Koeppel H, Frey D, Adelmann K, Klingbeil K, Mack M, Hoffmann GF, Janssen B, Zschocke J, Yard BA
