Prozessierung von Chaperonsubstraten in C. elegans

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Klaus Richter
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2007 bis 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 48759762

In diesem Projekt werden wir die biochemischen Mechanismen der Substratprozessierung durch Hsp90 und Hsc70 und ihre Beziehung zu bestimmten Phänotypen in Caenorhabditis elegans untersuchen. Wir werden die Prozessierung verschiedener Kinasen durch den CDC-37/CeHsp90 Chaperonkomplex analysieren, um Interaktionsprinzipien aufzudecken, die für alle Kinasesubstrate gelten. So beobachten wir, dass lediglich nukleotidfreie sB-Raf Kinase an CDC-37 binden kann und wollen nun testen, inwieweit Nukleotidbindung auch bei anderen Kinasen die Chaperoninteraktion reduziert. Die Interaktion mit der DYRK-homologen Kinase MBK-2 und phänotypischen MBK-2 Varianten soll verwendet werden, um zu verstehen, wie Punktmutationen die Bindung an CDC-37/CeHsp90 steuern und die Anforderungen an CDC-37 in C.elegans sollen spezifiziert werden, indem bestimmte Bereiche dieses Cofaktors mit Hilfe von CRISPR/Cas9 ausgeschaltet werden. Daneben werden wir die Funktionalität der Hsp90-assoziierten Phosphatase PPH-5 und die Regulierung ihrer Aktivität analysieren. PPH-5 ist bei der Bindung der Substrate GR und CDC-37 von Hsp90 abhängig und auch bei der Dephosphorylierung seiner Substrate. Wir prüfen nun, ob ternäre Komplexe auch für weitere Substrate von PPH-5/CeHsp90 notwendig sind. Um die Regulation zu verstehen, werden wir auch PPH-5 Varianten untersuchen, die in C. elegans zu Phänotypen führen und neue C. elegans Stämme erzeugen, bei denen PPH-5 nicht mehr funktional ist. Für die ternären Substratkomplexe von CDC-37/CeHsp90 und PPH-5/CeHsp90 werden wir darüber hinaus strukturelle Eigenschaften ermitteln, die die Organisation dieser Komplexe und deren Umgang mit Substratproteinen verdeutlichen.Als drittes Chaperonsystem, das deutliche Phänotypen in C. elegans produziert, untersuchen wir die Wechselwirkung zwischen DNJ-13/Hsp40, UNC-23 und CeHsc70. Mutationen in unc-23 führen zu Defekten bei der Verankerung von Muskelzellen, ähnlich einer Muskeldystrophie. Diese Defekte können unterdrückt werden, wenn zusätzlich die DNJ-13 Expression verringert wird. Wir werden vier Varianten von CeHsc70 analysieren, die ebenfalls eine Resistenz gegen diesen Phänotyp vermitteln. Dazu werden wir unter anderem die Bindung an DNJ-13 testen, um biochemische Veränderungen der Hsc70 Varianten zu definieren und es wird getestet werden, ob weitere Funktionen von CeHsc70 in C. elegans durch die Mutationen verändert sind. CRISPR/Cas9 werden wir verwenden, um Bereiche von DNJ-13 zu modifizieren, die den Einfluss auf die Muskelfunktion verantworten. Zuletzt wollen wir untersuchen, wie eine direkte Interaktion zwischen CDC-37 und DNJ-13, die wir beobachten konnten, die Substratprozessierung von CDC-37/Hsp90 beeinflussen könnte. Diese drei Systeme liefern somit einen Einblick in die Funktionsweise der molekularen Chaperone und die Mechanismen der Substratprozessierung und helfen krankheitsähnliche Phänotypen, verursacht durch Mutationen in Chaperonen, Cofaktoren oder ihren Substraten, zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen