Beeinflussen Bewegungen von Proteindomänen auf der Mikrosekundenskala die Aktivität von Enzymen? Eine Einzelmolekül-FRET Studie

• Antragsteller: Dr. David Scheerer
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 490757872

Proteine besitzen ein breites Spektrum an Aufgaben, sie fungieren als Enzyme, Transporter und mehr. Viele von ihnen nutzen ausgedehnte Bewegungen von Domänen um ihre Aktivität zu steigern. Die Untersuchung der konformellen Dynamik von Proteinmaschinen ist essentiell für die Entschlüsselung ihrer Funktionsweise und ihrer Regulierung. Das durch solche Studien gewonnene Wissen ist nicht nur sehr relevant für das Design neuer Proteine, sondern kann auch bei der Entwicklung von Medikamenten ungeahnte Möglichkeiten eröffnen.Die genaue Beziehung zwischen konformeller Dynamik und dem chemischen Schritt enzymatischer Katalyse wird extensiv diskutiert. In verschiedenen Enzymen befindet sich das aktive Zentrum in einer Lücke zwischen zwei Domänen, und durch strukturelle Umlagerungen werden die Domänen über dem gebundenen Substrat geschlossen. Während aktuelle experimentelle Techniken, von Röntgenkristallographie bis zur Kryo-Elektronenmikroskopie, die Endpunkte solcher Bewegungen leicht beobachten können, ist die Messung damit verbundener Zeitskalen oft eine Herausforderung. Einzelmolekül-FRET (smFRET) Spektroskopie kann großräumige Bewegungen in Echtzeit aufzeichnen, verbunden mit dem großen Vorteil, dass eine Bandbreite an Zeitskalen abgedeckt wird. Kombiniert mit H2MM, einem Photon-für-Photon-Algorithmus, haben smFRET-Studien am Enzym Adenylatkinase (AK) kürzlich sehr schnelle Domänenbewegungen aufgedeckt, die zwei Größenordnungen schneller sind als die Umsatzrate des Enzyms. Zahlreiche Zyklen konformeller Umlagerungen tragen möglicherweise dazu bei, eine relative Orientierung der Substrate zu finden, die für die chemische Reaktion optimal ist. Vorläufige Studien zur Wirkung von Harnstoff auf die Substratinhibition von AK bekräftigen diese Idee und deuten darauf hin, dass ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Domänenöffnung und -schließung für effiziente Katalyse wichtig ist.Jedoch ist noch nicht klar, ob dieses Verhalten ein spezifisch für AK ist oder für eine Vielzahl von Enzymen gilt. Dies erfordert eine Ausweitung unserer Studien auf andere Proteine. Im Enzym Phosphoglyceratkinase (PGK) wird die katalytische Reaktion von einer weiträumigen Biegebewegung begleitet, wodurch es ein ideales Ziel für die Klärung dieser Frage darstellt. Wir werden fragen: Wie schnell sind die Bewegungen? Was ist die Verbindung zwischen katalytischer Reaktion und Domänenbewegung? Sind Bewegungen innerhalb einer Domäne notwendig, um den vollständig geschlossenen Zustand zu erreichen? Die von uns vorgeschlagenen smFRET-Experimente leisten einen wichtigen Beitrag zur Klärung dieser Fragen. Das Ziel ist es, Korrelationen zwischen den Bewegungen des Proteins und seiner Aktivität aufzudecken.Zusammengefasst werden wir nicht nur schnelle Domänenbewegungen in PGK charakterisieren, sondern auch eine schlüssige Rolle dieser Bewegungen in der Enzymkatalyse etablieren. Dies hat das Potenzial, unser Bild von der Beziehung zwischen Dynamik und Funktion drastisch zu verändern.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: Israel
• Gastgeber: Professor Dr. Gilad Haran