Aufklärung des Mechanismus der Baculovirus-Resistenz (Typ I) beim Apfelwickler durch Identifizierung des PE38-Bindungskomplexes während der CpGV-Infektion in Cp14R-Zellen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Apfelwickler (Cydia pomonella) ist der Hauptschädling im Kernobstanbau weltweit. Die Larven fressen sich in unreife Äpfel oder Birnen und entwickeln sich darin weiter, was zu unverkäuflichen Früchten und erheblichen wirtschaftlichen Verlusten fü hrt. Verschiedene Cydia pomonella granulovirus (CpGV)-Präparate, darunter auch resistenzbrechende CpGV-Isolate, werden erfolgreich zur Verringerung des Befalls und zur Vermeidung von Fruchtschäden durch anfällige und CpGV-resistente (Typ I-III) Apfelwicklerpopulationen im Kernobstanbau sowohl im ökologischen als auch im integrierten Pflanzenschutz (IPM) eingesetzt. Die Typ-I-Resistenz des Apfelwicklers gegenüber CpGV wurde in Europa in zahlreichen Ländern festgestellt, weshalb die Charakterisierung des molekularen Mechanismus der weit verbreiteten Typ-I-Resistenz beim Apfelwickler besonders wichtig erscheint. Das Verständnis des zugrundeliegenden Resistenzmechanismus ist fü die r Weiterentwicklung geeigneter Resistenzmanagementstrategien von entscheidender Bedeutung. In früheren Veröffentlichungen wurde berichtet, dass die Vererbung der CpGV- Resistenz vom Typ I dominant und mit dem Z-Chromosom verbunden ist. Darüber hinaus wurde das virale pe38 als Gen, das für die Brechung der Typ-I-Resistenz beim Apfelwickler verantwortlich ist, idetifiziert. Das vorliegende Projekt hatte das Ziel, die molekulare Grundlagen der Typ-I-Resistenz beim Apfelwickler durch zwei Ansätze zu identifizieren: (1) Entschlüsselung der Komponenten des viralen PE38-Komplexes bei der CpGV-Infektion des Apfelwicklers; (2) Z-chromosomaler Vergleich zwischen CpS (anfällig) und CpRR1_22 (Typ-I-Resistenz). Hierzu wurde das Sleeping Beauty-Transposon-System eingesetzt, um eine transformierte Cp14R-pe38- Zelllinie zu etablieren, die die geringe PE38-Expression in CpGV-infizierten Larven überwinden kann. Es wurde der Transposon-Donor-Vektor pT2/HB-hsp-pe38-mCherry2- Zeocin konstruiert. Die vollständige Plasmidsequenz bestätigte, dass hsp-pe38-mCherry2- Zeocin korrekt in das pT2/HB-Plasmid eingefügt wurde. Western Blotting Experimente zeigten, dass das His-PE38-mCherry2-Protein (75,13 kDa) kontinuierlich in E. coli exprimiert werden konnte. Transformierte Cp14R-pe38-Zellen wurden mit Zeocin selektiert und durch inverse PCR, nested PCR und Sequenzierung validiert. Diese positiven Zellkolonien mit mCherry2-Fluoreszenzaktivität wurden mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die erzeugte Cp14R-pe38-Zelllinie wächst gut und konnte im Labor kontinuierlich weitergezogen werden, um die grundlegende Frage zu untersuchen, wie der Apfelwickler die CpGV- Replikation im Frühstadium der Infektion blockiert und wie man die Typ-I-Resistenz und weitere Resistenzfälle durch Unterbrechung dieses Infektionsweges reduzieren/beseitigen kann. Zu weiteren Identifizierung des Resistenzmechanismus wurde die gesamte Genomsequenz der anfälligen (CpS) und der resistenten (CpRR1_22) Larve mittels MinION Mk1C (MC-110201, Oxford Nanopore Technologies) erstellt (BUSCO-Score von 98,39 % bzw. 98,37 %). Die Z-chromosomalen Sequenzen von CpS und CpRR1_22 wurden mithilfe der GeMoMa-Pipeline annotiert und verglichen, um die Typ-I-Resistenzmarker zu identifizieren. Es gibt 1350 Gene, die CpS und CpRR1_22 gemeinsam haben, während 200 Gene spezifisch für CpS und 156 Gene spezifisch für CpRR1_22 sind. Diese genetischen Unterschiede können als Typ-I-Resistenzmarker weiterentwickelt werden, die zum weiteren Screening des resistenten Hintergrunds von Apfelwickler-Feldindividuen verwendet werden können. Die Aufklärung des Mechanismus der CpGV-Resistenz gegen den Apfelwickler und die Identifizierung der Typ-I-Resistenzmarker beantwortet nicht nur drängende wissenschaftliche Fragen, sondern weist auch neue Wege für den nachhaltigen Einsatz von CpGV in der Kernobstproduktion.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Chromosome-level comparison between susceptible and resistant codling moth strains to decoding the mechanism of CpGV resistance of codling moth [Conference oral presentation abstract], Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Vienna, Austria..
Jiangbin Fan, Fang-Shiang Lim, Jö T. Wennmann, David Heckel, Petr Nguyen & Johannes A. Jehle
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Identification of the molecular basis of CpGV resistance in codling moth, Cydia pomonella [Conference poster presentation abstract], Annual Meeting of the Society for Invertebrate Pathology, Vienna, Austria.
Jiangbin Fan, Jö T. Wennmann & Johannes A. Jehle
