Erkundung der Protein-DNA Grenzfläche in lebenden Zellen mittels photo-vernetzter Peptid-Nukleotid Hybride

• Antragsteller: Dr. Jakob Trendel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 492625837

Während der vorhergehenden Förderperiode entwickelte ich zukunftsweisende Methodik zur Photo-Vernetzung von Protein-RNA Interaktionen unter Verwendung hochintensiver UV-Bestrahlung und deren Analyse mittels Massenspektrometrie-basierter Proteomik. Diese Methodik setzte ich ein, um die Reaktion des menschlichen und murinen RNA Interaktoms auf verschiedene RNA-bindende Wirkstoffe zu untersuchen. Ich entdeckte, dass neben der Protein-RNA Vernetzung die neue Methodik auch für die Photo-Vernetzung von Protein und DNA genutzt werden kann. Ich setzte diese neuartige Herangehensweise ein, um das Proteom mit physischem Zugang zur DNA in menschlichen Brustkrebszellen zu erkunden, sowie um Veränderungen in deren DNA Interaktom gegenüber Estrogen und genotoxischer Wirkstoffe zu untersuchen. Eine eingehende Analyse der Massenspektrometriedaten dieser DNA Interaktome zeigte, dass sie zahlreiche Peptide enthielten, die mit einem photo-vernetzten DNA Nukleotid modifiziert waren. Diese Nukleotid-vernetzten Peptide sind von besonderem Interesse, da sie einen direkten Nachweis für eine Protein-DNA Interaktion liefern und die DNA Grenzfläche innerhalb der Proteinsequenz mit der Auflösung einzelner Aminosäuren lokalisieren. Im vorgeschlagenen Projekt werde ich die Protein-DNA Grenzfläche mittels DNA-vernetzter Peptide erkunden, um Proteinsequenzmerkmale zu identifizieren, die physischen Zugang zum Genom haben. In drei Arbeitspaketen werde ich i) die Detektion von Nukleotid-vernetzten Peptiden durch einen zusätzlichen Anreicherungsschritt verbessern, ii) den verbesserten Ansatz nutzen, um Protein-DNA Grenzflächen in verschiedenen Zelllinien zu untersuchen, und iii) potenziell neue DNA-bindende Peptidsequenzen mit AlphaFold3 und synthetischen Peptiden weiterverfolgen. Da die Vernetzung nur an einer oder wenigen Stellen innerhalb eines Protein-DNA Komplexes auftritt, werde ich zusätzlich eine Anreicherung mit Titandioxid anwenden, um unvernetzte Peptide zu eliminieren und eine größere proteomische Tiefe für Nukleotid-vernetzte Peptide zu erreichen. Um so viele Protein-DNA Interaktionsstellen wie möglich zu katalogisieren und deren Variabilität zu quantifizieren, werde ich diese optimierte Herangehensweise dann auf humane und murine Zelllinien unterschiedlicher Gewebeherkunft und nach verschiedenen Behandlungen anwenden. Uncharakterisierte Proteinsequenzmerkmalen, die in den Vernetzungsexperimenten identifiziert wurden, werden folglich mit Alphafold3 nach ihrer Fähigkeit untersucht, stabile Komplexe mit DNA zu formen, und Peptidkandidaten synthetisch hergestellt um deren DNA Binding in vitro zu validieren. Zusammenfassend werde ich im vorgeschlagenen Projekt das Proteom an der Grenzfläche zur DNA mit neuartiger Photo-Vernetzungsmethodik untersuchen, um Proteinsequenzmerkmale zu katalogisieren und quantifizieren, die in lebenden Zellen mit dem Genom interagieren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen