In Vivo Charakterisierung von kleinen Molekülen mit RNA Wirkziel mittels UV-Crosslinkender Proteomik

• Antragsteller: Dr. Jakob Trendel
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 492625837

Protein-RNA Interaktionen sind die Grundlage vieler biologischer Prozesse und ihre Manipulation ist ein fortwährendes Ziel im Vorhaben Krankheiten zu heilen. Erst kürzlich wurde der Splicing Modulator Risdiplam als erstes kleines Molekül, welches RNA als Wirkziel hat, von der FDA und EMA zur Behandlung von spinaler Muskelatrophie (SMA) zugelassen. Obwohl es den zentralen U1 Komplex des Spliceosomes bindet, scheint Risdiplam spezifisch das Splicing vom SMN2 Gen und nur weniger anderer Gene zu verändern. Es wurde daher spekuliert, dass weitere, bisher unbekannte Faktoren an der Spezifität des Wirkstoffs beteiligt sein könnten. Vor einiger Zeit haben wir XRNAX entwickelt – eine Methodik zur UV-crosslinkenden Proteomik, welche die systemweite Quantifizierung von Proteinen erlaubt, die an RNA gebunden sind. Wir haben diese Methodik nun erweitert und UV-crosslinkende Instrumente konstruiert, welche auf Licht emittierenden Dioden (LEDs) basieren. Vorläufigen Experimenten zeigen, dass diese das Crosslinken von Protein-RNA Komplexen und deren Analyse mittels Massenspektrometrie maßgeblich verbessern. In diesem Projektvorschlag verwenden wir diese neuartige Technologie, um zu untersuchen, wie Wirkstoffe wie Risdiplam Protein-RNA Interaktionen verändern und welche Rückschlüsse das über ihren in vivo Wirkmechanismus zulässt.Die Fragestellung wurde in einem dreiteiligen Arbeitsprogramm erfasst, in welchem UV-LED Crosslinken und XRNAX verwendet wird, um I) Wirkstoffe mit RNA Wirkziel in der Zellkultur zu charakterisieren, II) das RNA-bindende Proteome der Maus abzuleiten und III) die Wirkung von Splicing Modulatoren auf Protein-RNA Interaktionen in Mäusen zu quantifizieren. Im ersten Arbeitspaket werden wir hierfür die Dosis- und Zeit-abhängige Wirkung von Risdiplam und neun weiterer Wirkstoffe an menschlichen, kultivierten Zellen quantifizieren. Diese Analyse wird Protein-RNA Interaktionen herausheben, welche für die Funktion der Substanzen wichtig sein könnten. Im zweiten Arbeitspaket werden wir einen Katalog an RNA-bindenden Proteinen aus fünf Mausorganen erstellen, um gewebespezifische Unterschiede herauszuarbeiten. Schließlich werden wir im dritten Arbeitspaket die in vivo Wirkung von Risdiplam auf Protein-RNA Interaktionen aufklären und zur Wirkung eines weiteren SMN2 Splicing Modulators namens Branaplam vergleichen. Wir erwarten, dass ein Dosis-abhängiger Vergleich beider Substanzen gleichartige Protein-RNA Interaktionen herausstellen könnte, welche wiederum ihre verwandte Spezifität erklären könnten. Unsere Daten werden zur online Einsicht auf ProteomicsDB aufgearbeitet.Zusammenfassend wird in diesem Projektvorschlag UV-crosslinkende Proteomik angewendet, um Wirkstoffe mit RNA Wirkziel in der Zellkultur und dem Mausmodell zu untersuchen. Wir sind der Überzeugung, dass dies einen maßgeblichen Beitrag zum allgemeines Verständnis von Protein-RNA Interaktionen leisten wird und gleichwohl für die Forschungsgemeinschaft, die diese untersucht.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen