Domäneninteraktion für die Membranassoziation von pflanzlichen ARF-GEFs des GBF1-Typs – mechanistische und evolutionäre Analyse

• Antragsteller: Professor Dr. Gerd Jürgens
• Fachliche Zuordnung: Zell- und Entwicklungsbiologie der Pflanzen
• Förderung: Förderung seit 2021
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 492659015

Die subzelluläre Verteilung von Proteinen mit Hilfe von Transportvesikeln (membrane traffic) spielt bei Entwicklungsvorgängen und physiologischen Prozessen von Eukaryoten eine wesentliche Rolle. Zur Bildung von Transportvesikeln werden kleine ARF-GTPasen durch GDP-GTP-Austausch aktiviert, der von ARF-Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (ARF-GEFs) katalysiert wird. Große ARF-GEFs wie GBF1 bei Säugern oder GNOM bei Pflanzen bestehen aus 6 konservierten Domänen: Auf die N-terminale DCB-Domäne (Dimerisierung) folgen HUS, SEC7 (GDP-GTP-Austausch) und HDS1 - HDS3; davon sind HUS und HDS1-3 funktionell nicht charakterisiert. Bei GBF1 aus Säugern interagiert die DCB-Domäne mit der benachbarten HUS-Domäne. Im Gegensatz dazu interagiert beim GBF1-ähnlichen GNOM die DCB-Domäne mit dem komplementären deltaDCB-Fragment – es werden die drei Domänen HUS, SEC7 und HDS1 benötigt –, und diese Interaktion ermöglicht die Membranassoziation von GNOM. Der Unterschied in der Domäneninteraktion korreliert mit einem Unterschied im subzellulären Wirkort dieser beiden ARF-GEFs. GBF1 vermittelt am Golgi-Apparat die Bildung von COPI-Vesikeln für den retrograden Transport zum ER, während GNOM an Endosomen für das polare Recycling des Auxinefflux-Transporters PIN1 zur basalen Plasmamembran benötigt wird. Das Ziel dieses Vorhabens ist es, den Mechanismus der Domäneninteraktion zu verstehen, die für die Membranassoziation von GNOM verantwortlich ist. Es werden zwei Ansätze verfolgt, bei denen sowohl Hefe-Interaktionsexperimente als auch funktionelle Analysen in Arabidopsis durchgeführt werden. In einer evolutionären Strategie werden ARF-GEFs aus verschiedenen eukaryotischen Arten untersucht, um zu klären, wo innerhalb der Eukaryoten die Grenze zwischen ARF-GEFs vom allgemeinen GBF1-Typ und denen vom pflanzlichen GNOM-Typ verläuft. Darüber hinaus verfolgt diese Abgrenzung ein praktisches Ziel. Um Einblicke in Mechanismen der Domäneninteraktion von GNOM zu gewinnen, sollen chimäre Proteine analysiert werden, deren komplementäre Abschnitte von AtGNOM und von einem möglichst nah verwandten allgemeinen GBF1 stammen; dadurch soll das Risiko möglicher Inkompatibilitäten auf Grund von großen evolutionären Distanzen minimiert werden. Das Ziel dieses zweiten Ansatzes ist es, die relevanten Sequenzmotive zu identifizieren, die die DCB-deltaDCB-Interaktion ermöglichen. Die geplanten Experimente könnten Unterstützung durch ein Strukturmodell von GNOM erfahren, das derzeit erarbeitet wird. Zusätzlich zu diesen gerichteten Eingriffen wird ein Funktionstest zur Identifizierung der Interaktionsflächen vorgeschlagen, der auf der Zufallsmutagenese von GNOM-Domänen beruht. Dabei wird eine Population mutagenisierter Domänen auf den Ausfall der DCB-deltaDCB-Interaktion selektiert; zugleich wird sichergestellt, dass die mutanten Domänen ihre volle Länge aufweisen und lediglich die Fähigkeit zur Interaktion zwischen den komplementären Teilen verloren haben.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen