Funktionen des Ladens sowie der Modifizierung der Replikationsklammer in der Toleranz gegenüber DNA-Schäden

• Antragstellerin: Professorin Helle Ulrich, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 493154786

Eine präzise, effiziente Verarbeitung von DNA-Schäden während der Replikation ist essentiell, um Mutagenese, Chromosomenumlagerungen und die Entstehung von Krebs zu verhindern. Der Weg der DNA-Schadenstoleranz spielt eine wichtige Rolle beim Schutz des Genoms vor Replikationsstress, er kann aber auch durch die Induktion genetischer Veränderungen zur Genominstabilität beitragen. Einblick in seine Regulation ist daher der Schlüssel zum Verständnis der Mechanismen, die die Tumorentstehung verhindern oder fördern können. Wir planen nun, die Dynamik eines zentralen DNA-Replikationsfaktors, der Prozessivitätsklammer PCNA, und die Implikationen für Effizienz und Genauigkeit der DNA-Schadenstoleranz zu untersuchen. Es ist bekannt, dass die Modifikation von PCNA durch die posttranslationalen Modifikatoren Ubiquitin und SUMO die Wahl zwischen fehlerfreien und mutagenen Wegen der DNA-Schadenstoleranz reguliert; wir verstehen jedoch noch sehr wenig über die Zusammenhänge zwischen diesen Modifikationen und den Faktoren, die PCNA durch dessen Laden und Entladen aktivieren und inaktivieren. Eine Reihe von alternativen PCNA-Ladefaktoren wurde genetisch mit der DNA-Reparatur in Verbindung gebracht. Wir werden untersuchen, wie diese Faktoren die Assoziation von PCNA mit blockierten Replikationsgabeln bzw. postreplikativen einzelsträngigen Bereichen kontrollieren, wie sie von PCNA-Modifikationen beeinflusst werden und auf die genomweite Verteilung der DNA-Schadenstoleranz wirken. Weiterhin werden wir der Frage nachgehen, wie PCNA-Modifikationsmuster, d.h. die Verteilung von Ubiquitin und SUMO über die drei Untereinheiten der homotrimeren Klammer, die DNA-Schadenstoleranz und die Interaktionen mit den Ladefaktoren sowie wichtigen Mediatoren des Systems, wie der Ubiquitin-Ligase Rad5 und den an der Transläsionssynthese beteiligten DNA-Polymerasen, beeinflussen.Wir werden diesen Fragen mit Hilfe von genetischen und zellbiologischen Assays im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae nachgehen, wo eine Reihe von speziellen Instrumenten, wie regulierbare Promotoren und orthogonale Degron-Systeme, eine schnelle und präzise Manipulation der Proteinkonzentrationen über den Verlauf des Zellzyklus ermöglichen. Darüber hinaus wird eine manipulierte Version von PCNA dazu dienen, das Modifikationsmuster der Klammer zu untersuchen. Wir werden unsere genetische Analyse mit Next-Generation-Sequencing-Experimenten ergänzen, um einen genomische Einblick in die DNA-Schadenstoleranz zu erhalten, und mit biochemischen Assays, die den Mechanismus der PCNA-Modifikation aufklären sollen. Die hier beschriebenen Experimente werden einen Einblick in die grundlegenden Mechanismen geben, die in diesem universell konservierten Weg der Genomerhaltung am Werk sind, und können eine Grundlage für zukünftige Forschungen bieten, die darauf abzielen, die DNA-Replikation in Tumorzellen zu hemmen oder die mutagenen Effekte zu überwinden, die mit der Toleranz von DNA-Läsionen verbunden sind.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Israel
• ausländischer Mitantragsteller: Professor Dr. Martin Kupiec