Effiziente und selektive Codierung von Phosphoserin in Säugetierzellen unter Verwendung eines evolvierten Translationssystems.

• Antragsteller: Dr. Martin Spinck
• Fachliche Zuordnung: Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung von 2021 bis 2024
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 493404643

Die Proteinphosphorylierung ist entscheidend für die Koordination unzähliger zellulärer Prozesse. Allerdings ist die Identifizierung des Beitrags individuellen Phosphorylierung zur gesamten Signalantwort bisher eine Herausforderung. Die einfachste Methode besteht darin, die Phosphorylierung durch Aspartat nachzuahmen, jedoch reagieren viele wichtige Phosphoproteine ​​anders auf diese Aspartat Mutationen as auf Phosphorylierung. In diesen Fällen ist genetisch codiertes Phosphoserin eine attraktive Alternative. Beranek et al. (2018) zeigten, dass von Bakterien stammendes SepRSv1.0/tRNAv1.0CUA system die Kodierung von Phosphorylierung in Säugetierzellen ermöglicht, obwohl seine Nutzbarkeit durch das Durchlesen von Glutamin und die geringe Translationseffizienz erheblich eingeschränkt ist.Hier schlage ich einen anderen Ansatz vor, um ein adaptives und selektives System für die Kodierung von Phosphoserin (oder seines Analogons) in Säugetierzellen zu entwickeln: Ich möchte kritische Komponenten des SepRSv1.0 / tRNAv1.0CUA-Translationssystems in Hefe durch Protein Engineering weiterentwickeln. Hierin plane ich, das aktive Zentrum des eEF1-alpha-Sep / tRNAv1.0CUA-Komplexes und seine eukaryotische spezifische Schnittstelle as ziel für weiteres Engineering zu wählen, um die Phosphoserinbindung und dessen ribosomale Translation zu verbessern. Kandidaten mit verbesserter Phosphoserin-Codierung werden durch Hefedisplay von phosphorylierten Peptiden aus den konstruierten Mutanten Bibliotheken selektiert. Darüber hinaus werden die besten eEF1-alpha-Sep-Varianten unter Verwendung programmierbarer RNA-Bindungsproteine ​​an die target mRNA gebunden, um die Codierungseffizienz weiter zu verbessern und Effekte auf andere eucharistische mRNAs zu minimieren.Die Systeme(s) werden in Säugetierzellen unter Verwendung eines etablierten Assays für die Aktivierung der Mek1-Kinase getestet, und ich werde ihre Funktionalität am Beispiel der Aspartat resistenten S133 phosphorylierung von CREB demonstrieren. Das verbesserte System sollte die systematische Untersuchung individueller Phosphorylierung von protein in menschlichen Zellen ermöglichen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Jason Chin