Effiziente und selektive Codierung von Phosphoserin in Säugetierzellen unter Verwendung eines evolvierten Translationssystems.
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Alles Leben auf der Erde folgt dem zentralen Dogma, bei dem genetische Informationen in Form von DNA gespeichert, in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert und anschließend in Proteine übersetzt werden. Das Ribosom liest die mRNA gemäß dem universellen genetischen Code, in dem 20 kanonische Aminosäuren Triplett-Nukleotid-Codons zugeordnet sind. Jedes Codon wird von einer spezifischen Transfer-RNA (tRNA) erkannt, die das Codon mit einem Ende bindet und am anderen Ende die entsprechende Aminosäure trägt. Die Aminosäure wird durch eine tRNA-Aminoacyl-Synthetase (aaRS) an die tRNA gekoppelt, wobei jede Aminosäure ein einzigartiges tRNA/aaRS-Paar besitzt. Allerdings verfügen menschliche Zellen über eine zusätzliche regulatorische Ebene durch posttranslationale Modifikationen (PTMs), bei denen Aminosäuren nach der Translation chemisch verändert werden, um die Proteinfunktion zu steuern. Zur Untersuchung von PTMs wurden genetische Werkzeuge entwickelt, mit denen modifizierte Aminosäuren (nichtkanonische Aminosäuren) direkt in Proteine eingebaut werden können. Dies erfordert die Entwicklung neuer Translationselemente wie tRNAs, aaRS und modifizierte Aminosäuren. Diese Komponenten müssen „orthogonal“ sein, also neben dem natürlichen Translationssystem funktionieren, ohne die Integration der 20 kanonischen Aminosäuren zu stören. Für die Codierung von Phosphoserin wurde ein archaeales Cystein-tRNA/tRNA-Synthetase-Paar umprogrammiert. Dieses System zeigte jedoch außerhalb von Escherichia coli, dem ursprünglichen Organismus, in dem es entwickelt wurde, eine geringe Effizienz. Nach der Übertragung in Säugetierzellen verlor das System seine Aktivität, wobei insbesondere der Verlust der tRNA-Orthogonalität ein zentrales Hindernis darstellte. Die Mechanismen hinter diesem Verlust sind weitgehend unbekannt, was die gezielte Weiterentwicklung des Systems erschwert. Um dieses Problem zu lösen, entwickelte ich ein computergestütztes Werkzeug zur de-novo-Entwicklung aktiver und orthogonaler tRNAs für spezifische Organismen. Durch die Analyse hunderter tRNAs identifizierte ich Designprinzipien und integrierte sie in einen Algorithmus namens Chi-T. Zusammen mit einem unterstützenden Skript (RS-ID) generierte Chi-T funktionale tRNA/aaRS-Paare für zwei verschiedene Synthetasen in E. coli mit Trefferquoten von 1:8 (Arginyl-tRNA-Synthetase) und 1:32 (Tryptophanyl-tRNA-Synthetase). Dies ermöglicht die schnelle und skalierbare Entdeckung neuer orthogonaler tRNA/aaRS-Paare und stellt einen entscheidenden Schritt in der Entwicklung phosphoserin-codierender Systeme dar, die speziell für die Funktion in Säugetierzellen optimiert sind.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Automated orthogonal tRNA generation. Nature Chemical Biology, 21(5), 657-667.
Spinck, Martin; Guppy, Amir & Chin, Jason W.
