Entwicklung von 3Cs fixed-pair für gepoolte DNA-Exzisionen mit Einzelzell-Transkriptom Auflösung.

• Antragsteller: Professor Manuel Kaulich, Ph.D.; Professor Dr. Mario Looso
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Bild- und Sprachverarbeitung, Computergraphik und Visualisierung, Human Computer Interaction, Ubiquitous und Wearable Computing
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 495039689

Obwohl die CRISPR Technologie das Editieren von menschlicher DNA stark vereinfacht hat, bleibt das Verständnis von kodierenden und nicht-kodierenden Veränderungen eine große Herausforderung in Biologie und Medizin. Dies ist zum großen Teil auf technologische Einschränkungen, stochastische Ergebnisse von Gen-Editierungen und das Fehlen von messbaren Phänotypen zurückzuführen. Obwohl aktuelle Bemühungen, Genabhängigkeiten in menschlichen Zellen zu kartieren, beispiellose Erkenntnisse liefern, sind ähnliche Ansätze mit Genkombinationen oder nicht-kodierende Sequenzen bisher nicht realisierbar. Dies liegt vor allem am großen menschlichen Genom und an Einschränkungen der CRISPR Technologie. Unter Nutzung unserer 3Cs-Technologie schlagen wir hier vor, den experimentellen Rahmen für CRISPR-Screens von vordefinierten gRNA Kombinationen zur Untersuchung von nicht-kodierenden Sequenzen zu schaffen, sowie derer computergestützter Auswertung. Hierzu werden wir EXCIsions-SEquenzierung (EXCI-SEq) entwickeln, eine auf DNA-Exzision und Einzelzell-Transkriptom-basierende CRISPR-Technologie, beides Schlüsselbereiche der Antragsteller. DNA-Exzisionen werden für biologische Entdeckungen auf mehreren Ebenen genutzt. Erstens, die Identifizierung von gRNA-Parametern zur gezielten Deletion von genetischen Regionen wird über biologische Eigenschaften von fehlerhafter DNA-Reparatur informieren. Diese Parameter werden verwendet um die multiCRISPR2-Software zu implementieren, die das Design von gepaarten gRNAs ermöglicht. Zweitens, wir werden transkriptionelle Startstellen ausschneiden, um herauszufinden, ob die durch DNA-Exzision vermittelte Geninaktivierung das Auftreten von verkürzten Proteine umgeht. Durch die Anwendung von Einzelzell-Barcodes ermöglichen wir, InDel- und DNA-Exzisions-Mutagenese zu unterscheiden und zu extrapolieren, inwieweit verkürzte Proteine unser Wissen über Gen-Abhängigkeiten in menschlichen Zellen beeinträchtigen. Drittens, die Kopplung von DNA-Exzision mit Einzelzell-Transkriptomik wird neue Einblicke in die transkriptionellen Ziele von nicht-kodierenden Sequenzen geben. Die Anwendung von EXCI-SEq auf klinisch relevante miRNAs wird deren transkriptionelle Ziele identifizieren, um letztlich Vulnerabilitäten von nicht-kodierenden Sequenzen vorhersagen zu können. Letztens, eine Cloud-basierte Software-as-a-Service Plattform wird etabliert, um EXCI-SEq-Daten zu analysieren und zu erforschen. Durch die Aufteilung dieses Prozesses in drei Phasen wird Qualitätskontrolle, Datenanalyse, Datenvisualisierung und -exploration durch ein webbasiertes Frontend ermöglicht. Das hier vorgeschlagene Projekt stellt die erste gemeinsame experimentelle und computergestützte Arbeit dar, DNA-Exzisionen mit Einzelzell-Transcriptomics in menschlichen Zellen zu ermöglichen. Es verspricht, innovative Technologien und vielfältige biologische Einblicke in die Funktion und die damit verbundenen Vulnerabilitäten von kodierenden und nicht-kodierenden Veränderungen zu liefern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen