Analyse der molekularen Funktion von ALMS1

• Antragstellerin: Dr. Tina Beyer
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 497060278

Die autosomale-rezessive Erkrankung Alström Syndrom wird durch Mutationen in dem Gen ALMS1 hervorgerufen und führt zu einer hohen Variabilität und Schwere im Krankheitsbild der Patienten. Die Krankheit wird den Ciliopathien zugeordnet, welche auf eine Fehlfunktion von ciliären Proteinen beruhen. Cilien sind Zellfortsätze, die an zahlreichen zellulären Mechanismen und Signalprozessen beteiligt sind. Folglich führt ein Defekt ciliärer Proteine, wie ALMS1, zu zahlreichen Symptomen einschließlich Hörverlust, Fehlfunktion der Niere und des Herzens, Adipositas und retinale Degeneration. ALMS1 Protein ist am Basalkörper zu finden, welcher für die Cillienstruktur selbst, das polarisierte Lokalisieren des Ciliums und den selektiven Transport zu dem und in das Cilium wichtig ist. Für ALMS1 wird angenommen, dass es an der Cilienerhaltung, Cilien-abhängigen Transport und Signalprozessen beteiligt ist. Allerdings ist die genaue molekulare Funktion von ALMS1, auch aufgrund der Proteingröße von 461 kDa, nicht genau verstanden. In dem vorliegenden Projekt soll die Rolle von ALMS1 in Cilien-abhängigen Prozessen (z.B. Auf- und Abbau, Transportprozesse, Signalwege) in wildtypischen wie auch mutanten Zellen untersucht werden. Zum einen sollen mehr funktionell relevante Informationen durch die Untersuchung des ALMS1 Proteinkomplex in CRISPR/Cas generierten endogen markierten ALMS1 in Hek293T Zellen gewonnen werden. Die Verwendung endogen markierter Zellen wird es ermöglichen, stabile ALMS1-Komplexe (Flag- GFP-Tag) und transiente Interaktionen (BioID2-Tag) zu analysieren. Zusätzlich soll das endogen markierte ALMS1 in Kombination mit ciliertem Mausgewebe für die gewebespezifische Analyse der Protein-Protein Interaktionen verwendet werden. Zum anderen soll das Expressionsmuster und die Lokalisation von ALMS1 und dessen interagierenden Protein in Zellkultur und unterschiedlichen Geweben beschrieben werden. Als Drittes soll der Effekt von ALMS1-Knockout und spezifischen Mutationen untersucht werden. Dazu sollen retinale pigmentierte Epithelzellen verwendet werden, in welchen ALMS1 mittels CRISPR/Cas oder der Verwendung von Cytidin-Deaminasen/ Basen-Konvertierungsenzymen verändert wird. Um klonale Artefakte auszuschließen soll zuerst der Zellzyklus, -viabilität und -migration der ALMS1-Knockout und mutierten Zellen untersucht werden. Im Folgenden ermöglichen die Datensätze, welche aus Proteinkomplex-, Expressions- und Lokalisationsanalyse gewonnen werden, eine gezielte Untersuchung der mutanten Zellen. Es sollen Cilien-abhängige Prozesse angeschaut werden, unter anderem Ciliogenese, Stabilität des Basalkörpers, Protein- und Vesikeltransport und Signalprozesse. Basierend auf allen Daten, die in diesem Projekt gewonnen werden, wollen wir die molekulare Funktion von ALMS1 in Cilien-abhängigen Prozessen besser verstehen und beschreiben. Das wiederrum kann als Basis für zukünftige Untersuchungen der gewebsspezifische und krankheitsrelevante Prozesse genutzt werden kann.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen