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Projekt
Korrektur einer häufigen CRB1 Mutation mittels RNA-Baseneditierung - Entwicklung einer neuartigen Therapie der retinalen Degeneration
Antragsteller
Dr. Kevin Achberger; Professor Dr. Thorsten Stafforst
Fachliche Zuordnung
Augenheilkunde
Biochemie
Biochemie
Förderung
Förderung seit 2022
Projektkennung
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 498225961
Retinitis Pigmentosa (RP) und Lebersche kongenitale Amaurose sind Formen der Netzhautdegeneration, die durch Mutationen im CRB1-Gen verursacht werden können. Besonders häufig ist dabei eine Missense-Mutation, die durch einen einzelnen Nukleotidaustausch von Guanosin durch Adenosin verursacht wird. Bis heute gibt es keine Möglichkeit, die dadurch entstehende Erkrankung zu heilen oder auch nur effektiv zu behandeln. Eine mögliche Gentherapie mit Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren wird durch die Größe des CRB1-Gens, das die Kapazität des AAV übersteigt, und durch das Vorhandensein mehrerer CRB1-Spleißvarianten behindert.Eine Alternative zu klassischen gentherapeutischen Ansätzen bietet eine neuartige RNA-Base-Editing-Technologie. Mithilfe maßgeschneiderter Antisense-Oligonukleotide (ASOs) ist es möglich, das endogene RNA-Editing-Protein ADAR (Adenosine Deaminase Acting on RNA) zu rekrutieren, um einzelne Adenosinnukleotide ortsspezifisch und programmierbar in Inosin umzuschreiben. Da Inosin biochemisch als Guanosin interpretiert wird, kann dies zur Korrektur der ausgewählten, häufigen und krankheitsverursachenden CRB1-Mutation genutzt werden.Ziel dieser Studie ist es, chemisch und pharmakologisch optimierte ASOs zu entwickeln, die die ausgewählte Mutation bei Patienten rückgängig machen könnten. Um die Wirksamkeit dieser ASOs zu bestätigen, nutzen wir humane induziert pluripotente Stammzellen (iPSZ), welche bereits in der Vergangenheit generiert wurden. Im Detail nutzen wir Linien von zwei Personen, welche die CRB1 Mutation homozygot tragen und an RP leiden. Die iPSZ werden dann zu retinalen Organoiden differenziert, welche alle Zellen der Retina in einer physiologischen Anordnung beinhalten und funktionell sind, also beispielsweise auf Lichtreize reagieren können.In einem effektiven iterativen Entwicklungsprozess werden ASOs an retinalen Organoiden sowie an organoid-abgeleiteten 2D- und 3D-Müller-Glia-Zellen getestet. Die Wirksamkeit der Therapie wird durch Charakterisierung des Expressionsniveaus und der Lokalisation des CRB1-Proteins beurteilt, welche beide aufgrund der Mutation gestört sind. Das Ziel besteht darin, ein Lead ASO zu identifizieren, das den gewünschten biologischen Effekt mit hoher Wirksamkeit und Spezifität erzeugt. In einem nächsten Schritt wird dieses Lead ASO pharmakologisch weiter optimiert und profiliert. Dabei nutzen wir unser neu entwickeltes Retina-on-Chip-System, welches eine physiologisch genaue Modellierung der Pharmakokinetik ermöglicht. In einem letzten Versuch werden wir erste toxikologische und immunologische Daten erfassen, die als präklinischer Datensatz zur Vorbereitung einer nachfolgenden klinischen Studie dienen können.Insgesamt wird dieses Projekt eine neuartige ASO-Therapie etablieren, die Patienten heilen könnte, welche von einer häufigen CRB1-Mutation betroffen sind. Darüber hinaus stellt das Projekt eine Blaupause für eine tierversuchsfreie präklinische Entwicklung dieser neuen Wirkstoffe dar.
DFG-Verfahren
Schwerpunktprogramme
