Experimentlle Rekonstruktion der molekularen Evolution Atrazin-abbauender Enzyme

• Antragsteller: Professor Dr. Reinhard Sterner
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 501122718

Enzyme sind leistungsfähige Biokatalysatoren, die metabolische Reaktionen mit enormer Effizienz und Spezifität beschleunigen. Obwohl es interessant und wichtig ist zu verstehen, wie in der Natur neue Enzyme aus bereits existierenden entstanden sind, wurde dieser Prozess bislang nur wenig untersucht. Es ist offensichtlich, dass die zugrunde liegenden Mechanismen am besten anhand solcher Enzyme untersucht werden können, welche die Fähigkeit entwickelt haben, anthropogene Substanzen abzubauen. Da diese Stoffe erst seit einigen Jahrzehnten in der Natur vorkommen, muss sich die Evolution dieser Enzyme innerhalb dieses kurzen Zeitraums abgespielt haben. Ein gutes Beispiel dafür stellen die Proteine AtzA, AtzB und AtzC dar, die das Herbizid Atrazin abbauen können und es ihren Wirtsorganismen ermöglichen, die Spaltprodukte als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu nutzen. Ähnlichkeiten bezüglich der Aminosäuresequenz, der dreidimensionalen Struktur und des Reaktionsmechanismus legen nahe, dass die Atz Enzyme durch Genduplikation und nachfolgende Spezialisierung aus verschiedenen Mitgliedern der Amidohydrolase Superfamilie Subtyp III entstanden sind, von denen viele Nukleobasen deaminieren. In Übereinstimmung mit dieser Hypothese, zeigt das AtzB Enzym promiskuitive Guanindeaminase (GuaD) Aktivität. Im Rahmen des hier vorgeschlagenen Projektes soll diese Aktivität stark gesteigert werden. Dafür wird rationales Proteindesign angewandt werden, basierend auf einem detaillierten Vergleich von Aminosäurekonservierungsmustern, die die jeweilige Substratspezifität von AtzB und GuaD festlegen. In umgekehrter Richtung soll die gleiche Strategie verwendet werden, um AtzB Aktivität auf dem Grundgerüst der am nächsten verwandten Guanindeaminasen zu etablieren. Nach der Erzeugung von Enzymvarianten mit hohen promiskuitiven Aktivitäten, wird die Zahl der Mutationen systematisch reduziert werden. Dadurch werden die für die beobachtete Aktivität minimal notwendigen Aminosäureaustausche identifiziert und eine plausible evolutionäre Trajektorie von GuaD zu AtzB ermittelt werden. Zusätzlich werden die aktivsten Enzymvarianten mit ihren nicht-nativen Substraten kristallisiert und die Strukturen der entsprechenden Enzym-Ligand Komplexe gelöst werden, um die mechanistischen Grundlagen der neuen Substratspezifitäten aufzuklären. In analoger Weise wird die evolutionäre Entwicklung von AtzA aus einer Adenin- oder Cytosindeaminase analysiert werden. Die erwarteten Resultate werden neue Einsichten in die Mechanismen und Abhängigkeiten vermitteln, die evolutionären Prozessen zugrunde liegen, insbesondere bezüglich des erst sehr kurz zurückliegenden Erwerbs neuer enzymatischer Funktionen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen