Strukturelle Analysen zum Aufbau, sowie der Chromatinerkennung und -modifizierung des humanen KMT2D Komplexes

• Antragsteller: Dr. Simon Pöpsel
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 504090354

Enhancer sind genregulatorische Elemente, die Genexpressionsmuster während zellulärer Differenzierungsprozesse koordinieren. In seiner zentralen Funktion als Enhancer-Koaktivator ist der humane KMT2D (MLL4) Komplex essentiell für Entwicklung und Zelldifferenzierung. Chromatin-assoziierte Regulatoren sind üblicherweise Multi-Proteinkomplexe. Der KMT2D Komplex (KMT2Dc) besteht aus neun Untereinheiten, von denen zwei – UTX und KMT2D – enzymatisch aktiv sind und posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen katalysieren, die für Enhancer charakteristisch sind. Veränderungen der KMT2D und UTX Gene sind Auslöser erblicher Entwicklungsstörungen, z.B. des Kabuki Syndroms, und werden häufig in Krebs detektiert. Trotz zentraler Rollen in Entwicklung und Krankheitsprozessen sind die Mechanismen der Funktion, Chromatininteraktionen und Aktivitätsregulation von KMT2Dc weitgehend unbekannt. Vermutlich wegen großer, teils unstrukturierter Untereinheiten konnte KMT2Dc bisher nicht rekombinant für strukturelle Analysen hergestellt werden. Wir konnten endogenen KMT2Dc aus humanen Zellen isolieren und mithilfe von cross-linking gekoppelter Massenspektrometrie (CL/MS) Daten generieren, aus denen wir neue Informationen über die räumliche Anordnung von Proteindomänen im endogenen KMT2Dc ableiten können. Basierend darauf konnten wir Komplexvarianten zur rekombinanten Expression designen, die neben UTX und dem WRAD (WDR5, RBBP5, ASH2L und DPY-30) Kernkomplex diejenigen Bereiche des KMT2D Proteins enthalten, die wir anhand unserer CL/MS Daten als Interaktionszentren identifiziert haben. In diesem Projekt wird zunächst die Struktur dieser rekombinanten Komplexe mittels Kryo-Elektronenmikroskopie und Einzelpartikelanalyse (Cryo-EM) hochauflösend dargestellt. Es sollen folgende Fragen beantwortet werden: Wie sind UTX und Domänen von KMT2D in den Komplex eingebunden? Wie sind die aktiven Proteindomänen von UTX und KMT2D im Komplex angeordnet? Mithilfe rekombinanter Nukleosomen werden des Weiteren die Chromatinbindung und Erkennung spezifischer Histon-PTMs detailliert strukturell aufgelöst. Außerdem wird untersucht, wie sich Chromatinbindung und Histon-PTM Erkennung auf die Aktivitäten von KMT2D und UTX auswirken. Schließlich soll die Struktur des endogenen, vollständigen KMT2Dc mittels Cryo-EM untersucht werden, um die hochauflösenden Strukturdaten in den nativen Komplex einordnen zu können. Humane K562 Zellen werden dazu dienen, um festzustellen, wie die sich die Unterbrechung von Interaktionen innerhalb, sowie zwischen KMT2Dc und Chromatin auf seine Stabilität, Chromatinbindindung und Aktivität im zellulären Kontext auswirkt. Zusammengefasst erwarten wir durch strukturelle, biochemische und zellbiologische Ansätze zum Verständnis der Struktur und Funktionsweise von KMT2Dc beizutragen, indem wir mechanistische Modelle seines Aufbaus, der Chromatinbindung und Aktivität ermöglichen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen