Gezielte Genomintegration durch gentechnisch entwickelte Transposon und CRISPR/Cas9 Komponenten

• Antragsteller: Professor Dr. Zoltan Ivics; Dr. Claudio Mussolino
• Fachliche Zuordnung: Humangenetik ; Biochemie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 504353267

Ein ideales Gentransfer-Werkzeug würde die chromosomale Integration von therapeutischen Nukleinsäuren auf effiziente und ortsspezifische Weise ermöglichen, ohne unerwünschte Veränderungen des Zielgenoms zu verursachen, die zu potenziell schweren Nebenwirkungen führen könnten. Keine der derzeit verfügbaren Technologien erfüllt diese Anforderung. Designer-Nukleasen, einschließlich des CRISPR/Cas9-Systems, sind hochspezifisch in ihrer Wirkung, beruhen aber auf der Einführung eines Doppelstrangbruchs (DSB) in das Genom, um die Integration des Transgens am gewünschten Ziel zu fördern. Dies ist eine der gefährlichsten Formen der DNA-Schädigung, die das Genom erfahren kann. Darüber hinaus stellt die unbeabsichtigte Off-Target-Einführung von DSBs in das Genom ein erhebliches Sicherheitsrisiko dar. Integrierende Gentransportvektoren, einschließlich Viren und Transposons, haben den Vorteil, dass sie ihre genetische Fracht einfügen, ohne das Zielgenom zu beschädigen. Allerdings erfolgt die Integration in einer semi-zufälligen Art und Weise, wodurch das Risiko einer Aktivierung oder Inaktivierung von zellulären Genen durch die Integration besteht. In diesem Projekt zielen wir darauf ab, Genom-Engineering-Werkzeuge zu verbessern, um eine hocheffiziente und präzise Integration von therapeutischen Transgenen ohne DSB zu erreichen. Wir werden CRISPR/Cas9-Komponenten in das Gerüst der nicht-viralen, Sleeping Beauty (SB) Transposon-vermittelten Genintegration einbauen, um dessen Spezifität zu erhöhen. Wir evaluieren die Leistungsfähigkeit von Fusionsproteinen, die aus katalytisch inaktivem Cas9 und der SB-Transposase bestehen, hinsichtlich ihrer Potenz, SB-Transpositionsereignisse in Multikopie-Ziele und chromosomale Einzelkopie-Ziele zu lenken, die die Kriterien von genomisch sicheren Regionen erfüllen, die durch guide RNAs (gRNAs) spezifiziert werden. Wir werden eine neuartige SB-Transposase-Mutante untersuchen, die in Verbindung mit gRNA-vermitteltem Targeting zu vorselektierten genomischen Stellen einen signifikanten Gewinn an Spezifität aufweist. Wir werden die SB-Transposase so verändern, dass ihre intrinsische Integrationsaktivität verringert wird, wodurch sich das Gleichgewicht in Richtung gezielter Insertionen in Gegenwart von CRISPR/Cas9-Komponenten verschiebt. Wir werden Fusionsproteine entwickeln, die aus DNA-Reparatur-Faktoren bestehen, die die Transgen-Integration durch homologe Rekombination fördern, und aus Cas9-abgeleiteten Nickasen, die nur einen Strang der Ziel-DNA schneiden und somit die Notwendigkeit eines DSBs verringern würden. Schließlich werden wir die Leistungsfähigkeit des vielversprechendsten experimentellen Systems in therapeutisch relevanten menschlichen T-Lymphozyten evaluieren. Technologien zur effizienten, ortsgerichteten Transgen-Integration in sichere Regionen des menschlichen Genoms würden wesentlich zu einer allgemeinen Verbesserung des Sicherheitsprofils des Gentransfers bei menschlichen Anwendungen beitragen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen