Funktionelle und mechanistische Bedeutung des NLS-Motivs des zentralen Ethylenregulators EIN2 für den Ethylen-Signalweg

• Antragsteller: Professor Dr. Georg Groth
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen ; Pflanzenphysiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 504365166

Der Ethylen-Signalweg reguliert wichtige Wachstums- und Entwicklungsprozesse in Pflanzen. Ein zentrales Element dieses Signalwegs ist das membranintegrale Protein EIN2, das das Signal von der ER-Membran in den Zellkern überträgt. Während das EIN2 'cleave and shuttle'-Modell plausibel erklärt, wie das Signal vom ER zum Zellkern übertragen wird, müssen Komplexbildung mit ER-verankerten Rezeptoren, nukleozytoplasmatischer Transport und Kernimport von EIN2 noch weiter analysiert werden, um die molekularen Mechanismen der EIN2-Wirkung vollständig zu verstehen. Das Projekt zielt darauf ab, die an diesen Prozessen beteiligten zellulären Wege und Strukturen aufzuklären. Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass EIN2 und EIN2-NLS Peptide mit hoher Affinität an die Ethylen-Rezeptoren binden. Nun wollen wir die genaue Bindungsstelle des NLS-Motivs am Rezeptor aufklären. Auf der Grundlage dieser Informationen sollen Funktionsverlustmutanten für nachfolgende Pflanzenstudien entwickelt werden, um die mechanistische Relevanz und Bedeutung der NLS-Bindung an die ER-lokalisierten Rezeptoren für die Ethylen-Signalübertragung zu bewerten. Basierend auf der kanonischen NLS-Sequenz in EIN2 und initialen Arbeiten unseres Labors, die die Bindung eines EIN2-NLS Peptids an den nukleären Transportrezeptor IMPa7 zeigen, postulieren wir, dass der nukleozytoplasmatische Transport und der nukleäre Import von EIN2 durch das IMPa-IMPb-System vermittelt wird. In unserem Projekt werden wir uns auf die Erkennung der EIN2-Fracht durch die verschiedenen pflanzlichen IMPa-Isoformen konzentrieren. Dazu werden wir die molekularen Voraussetzungen in den verschieden IMPa-Isoformen (IMPa1-IMPa9) bestimmen, die zur Erkennung und Bindung von EIN2 erforderlich sind. Dazu werden wir quantitative Bindungsstudien und Strukturanalysen verschiedener IMPa-EIN2-Komplexe durchführen. Anschließende in planta Fluoreszenzstudien werden Aufschluss darüber geben, welche der EIN2-bindenden IMPa-Isoformen die EIN2-Fracht in den Zellkern importieren bzw. welche den Kernimport durch zytoplasmatische Retention hemmen und dadurch die Ethylen-Signalübertragung vom ER zum Zellkern unterbrechen können. Dadurch werden mögliche wichtige regulatorische Funktionen der IMPa-Familie für die Ethylen-Signalgebung aufgedeckt. Studien an IMPa- und EIN2-NLS Mutanten werden diese Analyse untermauern. Nach dem erfolgreichen Transfer von EIN2 in den Zellkern bleibt die Frage offen, durch welche molekularen Motive und Mechanismen EIN2 den Master-Transkriptionsfakor EIN3 im Zellkern stabilisiert. Wir werden uns dieser Frage widmen und die EIN2-EIN3 Interaktion anhand gut definierter Wildtyp- und mutierter Subdomänen beider Proteine untersuchen. Mit diesem Ansatz werden wir den EIN2-EIN3 Kernkomplex definieren. Auf der Grundlage dieses Wissens wollen wir die Struktur dieses Komplexes aufklären, um einen detaillierten Einblick in die molekularen Strukturen zu erhalten, die diese Wechselwirkung steuern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen