Strukturelle und biochemische Charakterisierung des CRISPR-Lon/T Komplexes

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Gregor Hagelueken
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 504766164

CRISPR (engl.: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist ein adaptives Immunsystem, das in vielen Bakterien und Archaeen vorkommt. Es speichert „Erinnerungen“ an überstandene virale Angriffe im Genom des Wirts-Bakteriums und zwar in Form von kurzen Abschnitten viraler Nukleinsäuren (30-40 Basenpaare). Diese „Erinnerungen“ werden transkribiert und in RNA-Protein Komplexe eingebaut. Bei einem erneuten Angriff können diese Sensor-Komplexe dann die entsprechenden fremden Nukleinsäuren detektieren und zerstören. In den letzten Jahren wurden eine Vielzahl verschiedener CRISPR Systeme entdeckt und untersucht. Dabei stellten sich die Typ III CRISPR Systeme als besonders komplex heraus. Hier synthetisiert der Sensor-Komplex beim Erkennen von viralen Nukleinsäuren sogenannte zyklische Oligonukleotide. Diese Signalmoleküle wiederum werden in der Wirtszelle von Effektor-Proteinen erkannt, die daraufhin eine komplizierte Antwort auf den viralen Angriff auslösen. Am besten untersucht sind Effektor-Proteine mit Nuklease Aktivitäten. Diese zerschneiden wirtseigene Nukleinsäuren und versetzen die Wirtszelle dadurch in einen Schlafzustand. In diesem Zustand kann die Zelle die virale Attacke besser überstehen. Inhalt dieses Antrags ist die Untersuchung eines neu entdeckten Typ III Effektors namens CRISPR-Lon. Die Vorarbeiten zu diesem Antrag zeigen, dass dieses 60 kDa Protein eine funktionelle Einheit mit dem kleineren (34 kDa) CRISPR-T Protein bildet. Im Gegensatz zu den erwähnten Effektor-Nukleasen handelt es sich bei CRISPR Lon jedoch um eine Protease, welche von einem zyklischen Oligonukleotid mit 4 AMP Untereinheiten aktiviert wird. Die Protease zerschneidet daraufhin CRISPR-T, welches wiederum eine sequenzspezfische Ribonuklease zu sein scheint.Das CRISPR-Lon/-T System zeigt einen völlig neuen Aspekt von Typ III CRISPR Systemen auf und hat erstaunliche Ähnlichkeiten zur eukaryotischen angeborenen Immunität, wo ebenfalls Proteasen wie z. B. Caspasen verwendet werden, um schnell auf "Notzustände" zu reagieren. Die Experimente in diesem Antrag sind darauf ausgelegt das CRISPR-Lon/-T System biochemisch, biophysikalisch und strukturell zu charakterisieren und offene Fragen wie die genaue Funktion von CRISPR-T zu beantworten. Gleichzeitig ist eine schaltbare Protease ein Werkzeug von großem biotechnologischem Interesse. Deshalb soll die Proteaseaktiviät und die Substratspezifität von CRISPR-Lon charakterisiert werden. Es soll geprüft werden, ob sich CRISPR-Lon in eukaryotischen Systemen verwenden lässt, um in situ solche Zellen negativ zu selektieren, bei denen z.B. eine Genom-Editierung nicht das gewünschte Ergebnis lieferte.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen