Untersuchung der Mechanismen der Translationsunterdrückung in Axonen von Motorneuronen des Charcot-Marie-Tooth-Krankheitsmodells

• Antragstellerin: Dr. Marina Chekulaeva
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 505351048

Charcot-Marie-Tooth (CMT) ist eine unheilbare Krankheit, die durch eine fortschreitende Degeneration der peripheren motorischen und sensorischen Axone verursacht wird. Sie führt zu schwachen Muskeln, Taubheit und Schwierigkeiten beim Gehen. CMT Typ 2D wird durch Mutationen mit einem toxischem Funktionsgewinn in dem Gen verursacht, das für die Glycyl-tRNA-Synthetase (GARS) kodiert, ein Enzym, das Glycin an seine passende tRNA bindet. Die molekularen Mechanismen dieser Krankheit waren bis vor kurzem noch unklar. In unserer jüngsten Arbeit (Mendonsa et al. 2021) konnten wir zeigen, dass die mutierte GARS eine abnorm hohe Affinität zu tRNAGly besitzt, wodurch der für die Translation verfügbare Pool an Glycyl-tRNA erschöpft wird und die Ribosomen an Glycin-Codons eine Pause einlegen.Unsere Arbeit hat zwar wesentliche Einblicke in den Mechanismus der CMT geliefert, aber es bleibt unklar, warum Mutationen in der ubiquitär exprimierten GARS vor allem die motorischen und sensorischen Axone der Patienten betreffen. Diese Wissenslücke ist vor allem auf einen Mangel an empfindlichen Ansätzen und die technischen Herausforderungen bei der Gewinnung einer reinen Population von Motoneuronen und der Isolierung subzellulärer neuronaler Kompartimente zurückzuführen. Unsere früheren Arbeiten haben eine effiziente Methode zur Trennung subzellulärer neuronaler Kompartimente für Omics-Analysen (Spatial Omics; Zappulo et al. 2017; Ciolli et al. 2019) entwickelt. Dazu gehört auch die hochauflösende Erstellung von Ribo-seq, eine Technik, die erforderlich ist, um den primären Translationsdefekt bei CMT zu entschlüsseln. Darüber hinaus haben wir ein robustes Protokoll entwickelt, um aus hiPSCs eine reine Population von Motoneuronen zu erzeugen. Dies versetzt mein Labor in die einzigartige Lage, den Mechanismus hinter der erhöhten Anfälligkeit der motorischen Axone für CMT zu entschlüsseln.Im aktuellen Antrag wollen wir translatorische Faktoren identifizieren, die in motorischen Axonen limitierend sind, und ihre Rolle in der CMT-Pathogenese aufklären. Zu diesem Zweck werden wir (1) hiPSC-Motorneuronenmodelle für CMT erzeugen, indem wir CMT-verursachende Mutationen mit CRISPR-Cas9 einführen. Als Nächstes werden wir (2) CMT-Motorneuronen in Axone und Zellkörper auftrennen und RNA-seq, Massenspektrometrie und Ribo-seq der isolierten subzellulären Kompartimente durchführen. Mit diesen Analysen werden wir die Translationskomponenten identifizieren, die nach unseren bisherigen Studien an der Ribosomenpause beteiligt sind (z. B. tRNA, GARS usw.) und die in den CMT-Motoraxonomen limitierend sind. Schließlich werden wir (3) die Rolle der identifizierten limitierenden Faktoren in der axonalen Pathologie mit Hilfe von Rettungs- und Depletionsexperimenten in Kombination mit räumlichen „omics“-Methoden und funktionellen Assays untersuchen. Das Verständnis der Mechanismen der axonalen Spezifität von CMT würde die effizientesten Behandlungsansätze nahelegen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen