Untersuchung der molekularen Mechanismen von RBMX-assoziierten Hirnstörungen und der funktionellen Redundanz der RBMXL1-Retrokopie bei Menschen und Mäusen

• Antragstellerin: Professorin Christel Depienne, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsneurobiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Experimentelle Modelle zum Verständnis von Erkrankungen des Nervensystems ; Humangenetik ; Kognitive, systemische und Verhaltensneurobiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 505514143

Das RBMX Gen auf X-Chromosom (Chr) bei Säugetieren kodiert für ein RNA-bindendes RMBX/hnRNP-G-Protein. Es reguliert als Teil der Spliceosom-Maschinerie das alternative Spleißen. Pathogene RBMX-Varianten zeichnen sich phänotypisch bei hemizygoten Männern durch intellektuelle Defizite, Hirn- und Augenfehlbildungen aus. RBMX weist viele Kopien in Genomen von Säugetieren auf, darunter mehrere Retrokopien in Autosomen. Die evolutiv jüngsten Retrokopien (RBMXL1 beim Menschen; Rbmxl1a und Rbmxl1b bei der Maus), sind das Ergebnis unabhängiger Retropositionen. Sie kodieren wahrscheinlich für funktionelle Proteine, die zu 96-98 % mit RBMX/Rbmx identisch sind und während der Gehirnentwicklung in beiden Spezies exprimiert werden. Wir haben insgesamt vier Familien mit neuen Mutationen identifiziert, die zu Hirnfehlbildungen führen.Die Hauptziele dieses Projekts bestehen darin, 1) die Mechanismen der Mutationen in diesen Familien zu untersuchen, und 2) die molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, durch die RBMX und seine funktionellen Retrokopien zur Gehirnentwicklung in Maus und Mensch beitragen. Wir werden iPSCs aus Fibroblasten von drei Patienten erzeugen und CRISPR-cas9 Genome Editing einsetzen, um i) die Mutation zu korrigieren und ii) RBMX, iii) RBMXL1 oder iv) beides zu inaktivieren. Wir werden Multiomics-Analysen (RNAseq und Proteomics) in Fibroblasten und neuronalen Vorläufern aus iPSCs durchführen. Dies soll dazu dienen Gene und Spleiß-Isoformen zu identifizieren, die von RBMX und RBMXL1 kontrolliert werden und die durch die Mutationen verändert sind. Um die Fähigkeit von RBMX-, RBMXL1- und RBMX-Mutantenproteinen zu testen, das Spleißen in vitro zu fördern werden zusätzlich Minigen-Assays eingesetzt. Zusätzlich werden Two-Hybrid-Screens durchgeführt, um Proteinpartner zu identifizieren, die die drei Proteine entweder gemeinsam haben oder sich von ihnen unterscheiden. Andererseits werden wir die in utero-Elektroporation von Mausembryonen nutzen. Dies dient dazu die zellulären und molekularen Folgen des Knockdowns von Rbmx und Rbmxl1 allein oder in Kombination zu untersuchen. Weiterhin kann die Kapazität des Wildtyps oder mutiertem RBMX getestet werden, die beobachteten Defekte zu beheben. Unsere experimentelle Strategie wird es ermöglichen „loss- und gain-of-function“ von RBMX sowie dominant-negative Auswirkungen auf RBMXL1 zu überprüfen. Ein dritter Teil wird darin bestehen, die in Menschen- und Mausmodellen gewonnenen Ergebnisse zu integrieren und die artspezifischen Beiträge von RBMX/Rbmx und seinen Retrokopien bei den Entwicklungsprozessen des Gehirns zu entschlüsseln. Zusammenfassend kann dieses Projekt bahnbrechende Erkenntnisse zu den Mechanismen liefern, durch die RBMX und seine Retrokopien die Gehirnentwicklung steuern. Darüber besteht das Potential zu identifizieren wie eine unabhängige, wiederkehrende Retroposition eines einzelnen Gens dazu beigetragen haben könnte, Größe und Funktion des Gehirns während der Evolution zu formen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: Frankreich
• Partnerorganisation: Agence Nationale de la Recherche / The French National Research Agency
• Kooperationspartnerin: Juliette Godin, Ph.D.