HPLC/ESI-Ionenfallen-Massenspektrometer
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Messungen von Proben aus dem Institut für Biochemie, Universität Lübeck: a) Proteinmessungen: Um die Kristallstruktur von Proteinen bestimmen zu können, müssen diese ggf. modifiziert werden. Eine Modifizierungsart ist der Einbau von Selenomethionin anstatt der natürlich vorkommenden Aminosäure Methionin in das zu untersuchende Protein. Um den Grad des Einbaus von Selenomethionin zu messen, wurden zunächst zur Etablierung des Messverfahrens verschiedene Testproteine gemessen (Cytochrom c, Ovalbumin, Lysozym, Clostripain, Carboanhydrase). Aus den Messungen des natürlichen und des mit Selenomethionin modifizierten Proteins HtrA, einer oligomeren Serinprotease, konnte der Einbau von 7 Selenomethioninresten in das Protein bestimmt werden. Da die Proteinsequenz nur 7 Methioninreste enthält, konnte somit ein vollständiger Einbau von Selenomethioninresten bestätigt werden. Routinemäßig wurde auch die Molmasse weiterer Proteine, an denen im Institut gearbeitet wird, wie zum Beispiel einer Protease aus dem St. Louis Encephalitis Virus (SLEV), bestimmt. b) Inhibitoren: Struktur-basierte antivirale Leitverbindungen werden mit dem ESI-MS-Gerät routinemäßig in Hinblick auf ihre Molekülgröße überprüft. Die Messungen erfolgen dabei im Regelfall im positiv-mode-, für einigeVerbindungen auch im negativ-mode-Meßverfahren. Zur genaueren Strukturbestimmung werden in den meisten Fällen auch MS/MS-Spektren der Verbindungen gemessen. Bei den Targetmolekülen, gegen welche diese Leitverbindungen gerichtet sind, handelt es sich im wesentlichen um nicht-strukturelle Proteine (Nsps) aus pathogenen RNA-Viren wie etwa SARS-CoV, West-Nile Virus, Chikungunya-Virus, Coxsackievirus und andre Enteroviren. Als Hauptzielproteine werden die 3C-Proteasen aus diesen Viren benutzt. Die synthetisierten Leitverbindungen gehören chemisch zur Gruppe der Michael-Akzeptoren, Benzotriazolester, Peptidaldehyde, Benzanilide sowie substituierter Pyrrole. Insgesamt wurden mehr als 300 Verbindungen und deren Vorstufen gemessen. Von diesen sind etwa 120 Substanzen für eine Patentierung vorgesehen. c) Nano-LC-Messungen: Tryptisch verdaute Proteine wurden mit Hilfe der nano-HPLC aufgetrennt und mit Hilfe des ESI-MS-Geräts analysiert. Bei den untersuchten Proben handelte es sich dabei im wesentlichen um Proteine, die im Infektions- oder Entzündungsprozess eine Rolle spielen, wie z.B. RelA (das im Zuge der Adaptation des prokarytischen Metabolismus und seiner Genexpression bei Umweltveränderungen eine Rolle spielt und als Virulenzfaktor wirkt), CPAF (eine chlamydiale Protease), zwei Fragmente von DegQ (einer Chaperon-Protease aus dem Periplasma von Legionella micdadei), PfICP (ein Cystein-Protease - Inhibitor aus Plasmodium falciparum) sowie der C- und N-terminalen Domäne des Mip-Proteins (macrophage infectivity potentiator, eines essentiellen Virulenzfaktors) aus Legionellen und Chlamydien. Da diese Proteine teilweise instabil sind, wurden neben den nativen Proteinen auch Degradationsprodukte untersucht, um den Abbau genauer charakterisieren zu können (C-terminal, N-terminal oder Schnittstellen innerhalb des Proteins). Ferner konnten auch Domänengrenzen mit ESI-MS bestimmt werden. Die Sequenzabdeckung erreichte dabei in einigen Fällen Werte von über 60%, was eine eindeutige Identifizierung ermöglichte. Messungen von Proben aus anderen Instituten der Universität Lübeck i) Institut für Chemie: In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Hanne Peters wurde das Molekulargewicht des peracetylierten Zuckers 2-Deoxy-2-N-13C-Acetyl- 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-ß-D Glucopyranose und seiner Vorstufen überprüft. Ferner wurden Untersuchungen zur Dimerisierung der Galaktosyltransferasen GTA und GTB durchgeführt. In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Karsten Seeger wurde die Größe der Domäne A2 des von Willebrand-Faktors bestimmt. ii) Klinik für Dermatologie und Venerologie: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Ralf Ludwig wurde die Größe von Proteinen gemessen, die an der Immunmodulation beteiligt sind. iii) Institut für Physik: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Christian Hübner wurde die Größe verschiedener Fluoreszenz-markierter Proteine bestimmt. iv) Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene: In Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Dr. Jan Rupp wurde versucht, Proteine der Einschlußmembran von Chlamydien zu identifizieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- A Structural View of the Inactivation of the SARS-coronavirus main proteinase by benzotriazole esters. Chem. Biol. 15, 597-606 (2008)
K.H.G. Verschueren, K. Pumpor, S. Anemüller, S. Chen, J.R. Mesters & R. Hilgenfeld
- Crystal structure of the middle domain of human poly(A)-binding protein-interacting protein 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 680-685 (2011)
J. Lei, J.R. Mesters, A. von Brunn & R. Hilgenfeld
- Peptide aldehyde inhibitors challenge the substrate specificity of the SARS-coronavirus main protease. Antiviral Res., (Epub ahead of print: August 11, 2011)
L. Zhu, S. George, M.F. Schmidt, S.I. Al-Gharabli, J. Rademann & R. Hilgenfeld
