Charakerisierung und funktionelle Analyse loopender und nicht-loopender Enhancer

• Antragsteller: Dr. Daniel Murad Ibrahim
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 508021690

Die räumliche Organisation des Genoms hat sich als wichtiger Faktor für die Kontrolle der Genexpression erwiesen. Wie Enhancer und Promotoren innerhalb der dreidimensionalen Chromatinstruktur interagieren, beginnt man gerade erst zu verstehen. Genomweite Analysen haben gezeigt, dass sich Säugetiergenome in einzelne Einheiten von ~1Mb falten, die als Topologisch Assoziierte Domänen (TADs) bezeichnet werden und in denen sich Enhancer und ihre Zielgene befinden. Weniger klar ist jedoch die Relevanz von Chromatin-Looping zwischen Enhancern und Promotoren innerhalb von TADs. Während einige Studien einen direkten Zusammenhang zwischen Enhancer-Promotor-Looping und Genaktivität belegen, sehen andere Studien weniger Beweise. Diese Diskrepanzen sind zum Teil auf experimentelle Unterschiede, insbesondere zwischen DNA-Sequenzierungs basierten Methoden (Chromosome Conformation Capture 4C-Seq, HiC) und Mikroskopie basierten Methoden (DNA-FISH). Darüber hinaus kann sich der Einfluss anderer regulatorischer Elemente innerhalb der TAD auf die Interpretation von Enhancer-Promoter-Looping auswirken. Trotz dieser technischen Herausforderungen haben wir bei der Analyse von 3D-Chromatin-Struktur embryonalen Mäuse und Hühnerherzen festgestellt, dass es tatsächlich unterschiedliche Enhancer-Klassen gibt: loopende und nicht-loopende Enhancer. Dies wirft die grundsätzliche Frage auf, wie wichtig 3D-Chromatin-Looping für die Enhancer-gesteuerte Genaktivität ist und ob einige Enhancer mehr auf 3D-Looping angewiesen sind als andere. Derzeitige funktionelle Reporter-Assays sind jedoch nicht geeignet, um den Einfluss der 3D-Chromatin-Kontakt auf die Enhancerfunktion systematisch zu testen, da sie Enhancer und Reportergen in der Regel bestenfalls innerhalb weniger Kilobasen voneinander positionieren.In diesem Antrag werden wir durch Kombination aus bioinformatischer Analyse, Genom-Engineering und Mikroskopie bestehende technische Defizite überwinden und die Rolle von 3D-Chromatin-Kontakten auf Enhancer-Funktion beschreiben. Ausgehend von unserem Enhancer-Datensatz von embryonalen Herz-Enhancern werden wir zunächst die genomischen Signaturen identifizieren, die loopende von nicht-loopenden Enhancern unterscheiden. Durch Anpassung und Erweiterung von Genom-Engineering-Techniken werden wir einen neuartigen long-range Enhancer-Reporter-Assay entwickeln, der speziell die Rolle von 3D-Chromatin-Looping für die Enhancerfunktion untersucht und mit sequenzierungs- und mikroskopiebasierten Analysen kombiniert werden kann. Schließlich werden wir den Long-Range-Enhancer-Assay mit 4C-seq, DNA-FISH und Expressionsanalysen kombinieren, die sich ergänzende Messwerte liefern und 3D-Chromatin-Looping mit Genaktivierung verbinden. Hierdurch werden wir die genetischen Merkmale charakterisieren, die das Enhancer-Promoter-Looping beeinflussen, eine neue experimentelle Plattform für die Enhancer-Analyse etablieren und direkt vergleichen, wie Chromatin-Looping mit Genexpression wechselwirkt.

• DFG-Verfahren: Schwerpunktprogramme
• Teilprojekt zu: SPP 2202: 3-D-Genomarchitektur in Entwicklung und Krankheit