Stickoxid-Metabolismus in Ralstonia eutropha H16 (ehemals Alcaligenes eutrophus)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das gasförmige Radikal Stickstoffmonoxid (NO) wird von Eukaryoten als Signalmolekül sowie im Rahmen der Immunabwehr gebildet. Denitrifizierende und nitrifizierende Bakterien bilden NO als Stoffwechselzwischenprodukt. NO Ist mäßig reaktiv, kann aber unter bestimmten Bedingungen schon im unteren mikromolaren Konzentrationsbereich toxisch wirken. Da NO leicht über Zellmembranen diffundiert, ist NO-Stress in bakteriellen Habitaten keine Seltenheit. Tatsächlich besitzen überraschend viele Bakterien Proteine, die NO sensieren oder umsetzen können. Die molekularen Mechanismen der Sensierung (und auch der Umsetzung) von NO sind allerdings nur unzureichend untersucht. In dem denitrifizierenden ß-Proteobakterium R. eutropha H16 wird das von der Nitritreduktase produzierte NO von dem Transkriptionsaktivator NorR sensiert. Durch NO aktiviertes NorR bindet stromauf des s54 Promoters des norAB Operons. Als Bindestelle wurden drei Kopien eines 13 bp umfassenden "inverted-repeat" (NorR-Box) identifiziert. Durch ortsspezifische Mutagenese konnte gezeigt werden, dass das Vorhandensein aller drei Boxen für eine Expression des norAB Operons in vivo essentiell ist. Unter anoxischen Bedingungen gereinigtes NorR trägt ein Eisenzentrum, indem ein einzelnes Eisenatom von vermutlich fünf Liganden der N-terminalen Sensordomäne von NorR koordiniert wird. Mit einem verkürzten, nur die Sensordomäne umfassenden NorR Teilprotein konnte gezeigt werden, dass dieses Eisenzentrum NO reversibel bindet. Das NorR-kontrollierte norAB Operon kodiert für eine respiratorische NO Reduktase NorB sowie für ein lösliches NO-bindendes Eisenprotein NorA. Das Eisenzentrum von NorA ähnelt dem Dieisencarboxylatzentrum von Hämerythrin. Im Gegensatz zu Hämerythrin bindet NorA jedoch zwei NO Moleküle pro Eisenzentrum in einem so genannten Dinitrosyl Eisenkomplex (DNIC), wobei eines der Eisenatome beide NO Liganden trägt. Da NorA und NorR um die Bindung von NO konkurrieren und NorR die Bildung von NorA kontrolliert, wird die NO-abhängige Aktivierung von NorR in einer Rückkopplungsschleife von NorA moduliert.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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2004. A DNA region recognized by the nitric oxide-responsive transcriptional activator NorR is conserved in beta- and gamma-proteobacteria. J Bacteriol 186:7980-7
Büsch, A., A. Pohlmann, B. Friedrich, and R. Cramm
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2005. Transcriptional regulation of nitric oxide reduction in Ralstonia eutropha H16. Biochem Soc Trans 33:193-4
Büsch, A., K. Strube, B. Friedrich, and R. Cramm
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2006. NO-dependent transcriptional activation of gene expression in Ralstonia eutropha H16. Biochem Soc Trans 34:182-4
Cramm, R., A. Büsch, and K. Strube
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2007. Characterization of the signaling domain of the NO-responsive regulator NorR from Ralstonia eutropha H16 by site-directed mutagenesis. J Bacteriol 189:2743-9
Klink, A., B. Elsner, K. Strube, and R. Cramm
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2007. Formation of a dinitrosyl iron complex by NorA, a nitric oxide-binding di-iron protein from Ralstonia eutropha H16. J Biol Chem 282:20292-300
Strube, K., S. de Vries, and R. Cramm
