Glykan-Sequenzierung an Oberflächen – Kombination von präparativer Massenspektrometrie und Rastersondenmikroskopie zur Entschlüsselung des Zuckercodes

• Antragsteller: Marko Grabarics
• Fachliche Zuordnung: Analytische Chemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 509729094

Biologische Informationen sind in der Sequenz von Biopolymeren wie Nukleinsäuren, Proteinen und Glykanen kodiert. Während für die DNA- und Proteinsequenzierung eine Vielzahl von automatisierten Methoden zur Verfügung stehen, ist die de-novo-Strukturaufklärung von Glykanen noch immer ein offenes Problem in der Biochemie. Im Gegensatz zu linearen Biopolymeren bilden Glykane verzweigte Strukturen mit komplexer Regio- und Stereochemie, was zu einer Vielfahlt von potenziellen Isomeren führt. Da es mit herkömmlichen Methoden der Glykomik oft unmöglich ist, Isomere zu unterscheiden und die richtige Glykanstruktur zu identifizieren, besteht ein deutlicher Bedarf an neuen Analyseverfahren, die alle regio- und stereochemischen Informationen ermitteln um eine eindeutige Sequenzzuordnung von Glykanen zu ermöglichen.Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung einer Glykan-Sequenzierungsmethode, die auf der direkten Abbildung von einzelnen Molekülen mit Subnanometer-Auflösung beruht. Zu diesem Zweck werden wir präparative MS mit modernsten Rastersondenmikroskopietechniken (RSM) unter Ultrahochvakuumbedingungen kombinieren und topographische Bilder von massenselektierten Glykanen erhalten, die auf atomar definierten Oberflächen abgelagert sind. Unter Verwendung einer einzigartigen präparativen MS-Apparatur werden wir die Methode unter Verwendung von Humanen Milch-Oligosaccharide (HMO) Standards als Modellverbindungen implementieren. Diese Moleküle weisen alle wichtigen Aspekte der strukturellen Komplexität von Glykanen auf und bieten somit eine ideale Plattform für die Entwicklung und Optimierung des Sequenzierungsverfahrens.Die Kombination präparativen MS und RSM wird eine Vielfahlt von neuen, praktischen Anwendungen ermöglichen. Aufbauend auf Grundlagenexperimenten an HMOs werden wir präparative MS und RSM in etablierte Glykomik-Arbeitsablaufes integrieren, um die O-Glykosylierung von Proteinen zu untersuchen. Die von Glykoproteinen freigesetzten O-Glykan-Ketten werden durch Flüssigchromatographie angereichert und fraktioniert, dann durch präparative MS auf sauberen Kristalloberflächen abgelagert, um ihre Sequenzierung mit hochauflösender RSM zu ermöglichen.Schließlich wird die Sequenzierung von Glykanen auf der Oberfläche erweitert, um chemische Modifikationen der Kohlenhydratkette zu untersuchen. Hier werden wir uns auf die Visualisierung des Sulfatierungsmusters von Glykosaminoglykanen (GAGs), einer Familie von stark sauren Polysacchariden, konzentrieren. Da die Anordnung der Sulfatgruppen die Bindung bioaktiver GAG-Sequenzen an Proteine bestimmt, ist die Entschlüsselung des Sulfatierungscodes für das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen dieser Moleküle unerlässlich. Zu diesem Zweck werden wir chemisch modifizierte RSM-Sonden verwenden, die durch höhere Auflösung und chemische Selektivität die Unterscheidung der funktionellen Gruppen fördern und dadurch ermöglichen, die Position der Sulfatmodifikationen in GAGs zu bestimmen.

• DFG-Verfahren: WBP Stipendium
• Internationaler Bezug: Großbritannien
• Gastgeber: Professor Dr. Stephan Rauschenbach