Formiat Translokation durch den FocA-Kanal: Wie die N-terminale Domäne die Anion-Spezifität moduliert

• Antragsteller: Professor Dr. Gary Sawers
• Fachliche Zuordnung: Stoffwechselphysiologie, Biochemie und Genetik der Mikroorganismen
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 510242854

Gärende Enterobakterien translozieren bei pH >6,5 Formiat aus dem Zytoplasma, wo es durch die Pyruvat-Formiat-Lyase erzeugt wird, ins Periplasma. Bei einem externen pH < 6,5 wird Formiat wieder in die Zelle aufgenommen, wo es durch den Formiat-Hydrogenlyase-Komplex zu CO2 und H2 disproportioniert wird. FocA, welches evolutionär zur Familie der Formiat-Nitrit-Transporter (FNT) gehört, führt die reversible Translokation von Formiat durch die Zytoplasmamembran durch. FNT-Proteine sind pentamere Kanäle von 150 kDa, die strukturell ähnlich zu tetrameren Aquaporinen sind. Jedes Protomer von FocA hat eine hydrophobe Pore, die Formiat in vivo reversibel transloziert. Der Mechanismus der Translokation ist jedoch unverstanden und steht im Mittelpunkt dieses Antrages. Die hydrophobe Pore enthält ein zentrales Histidin (H209), welches die einzige geladene Aminosäure in der Pore darstellt. Dieses Histidin ist hochkonserviert und die einzigen bekannten Ausnahmen haben entweder Asn oder Gln an dieser Position. Unsere Ergebnisse zeigen, dass FocA zu einem unidirektionalen Formiat-Efflux-Kanal wird, wenn H209 durch einen dieser nicht-protonierbaren Amidreste ausgetauscht wird. Dies weist darauf hin, dass H209 für die Formiataufnahme notwendig ist und es die physiologische Grundlage für die pH-abhängige Formiattranslokation bildet.Die Aminosäure T91 ist ebenfalls innerhalb der hydrophoben Pore hochkonserviert und befindet sich in der räumlichen Nähe von H209. Unsere Studien haben gezeigt, dass T91 für die reversible Formiattranslokation essentiell ist. Kürzlich konnten wir die 3,1 Å Struktur des kompletten FocA-Kanals mittels Kryo-EM (Zusammenarbeit mit P. Kastritis in Halle) auflösen, welche die Funktionen von H209 und T91 beim Poren-Gating unterstützt. Da fast alle FNT-Kanäle eine Reihe von konservierten Resten innerhalb der hydrophoben Pore jedes Protomers besitzen, muss die Spezifität zum anionischen Substrat durch einen alternativen Mechanismus determiniert werden. Wir konnten zeigen, dass die zytoplasmatische N-terminale Domäne von FocA für die in vivo-Funktion des Kanals essentiell ist. Zusätzlich zeigen unsere Daten, dass PflB spezifisch an diese N-terminale Domäne bindet, was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkung den Substratzugang zur Translokationspore kontrolliert. Darüber hinaus zeigen die N-terminalen Domänen verschiedener FNT-Proteine keine strukturelle Konservierung. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Spezifität des Substratzugangs durch die Interaktion unterschiedlicher Proteine mit der N-terminalen Domäne gesteuert werden könnte. Um diese Hypothese zu testen, planen wir bei drei unterschiedlichen FNT-Proteinen Experimente zum Domänen-Austausch. Die Hauptziele des vorliegenden Antrages sind daher, zu klären, wie die konservierten Reste in der Pore des FocA-Proteins die reversible Formiattranslokation steuern und die funktionelle Rolle der N-terminalen Domäne bei der Kontrolle der Formiatpassage aufzuklären.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen