Weiterentwicklung Connectase-basierter Proteinligationen und deren Anwendung in der Proteindetektion

• Antragsteller: Dr. Adrian Fuchs
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 512378754

Connectase ist eine neu entdeckte Proteinligase, ein Enzym, das zwei andere Moleküle über eine Erkennungssequenz aus Aminosäuren reversibel verknüpfen kann. Dieses Enzym bietet großes Potenzial für biotechnologische Anwendungen, beispielsweise für die Herstellung von hybriden Proteinen, die Immobilisierung von Zielproteinen oder deren Konjugation mit Pharmakophoren. Allerdings stehen wir erst am Beginn, dieses Potenzial zu erschließen. Sowohl das gebräuchliche Connectase Ortholog als auch seine Verwendung bieten großes Verbesserungspotenzial. Im ersten Teil dieses Projekts planen wir, die Ligationsreaktion zu manipulieren, um sie irreversibel zu machen und so höhere Produktausbeuten zu erzielen. Zudem werden wir eine Hochdurchsatzmethode zur Aktivitätsbestimmung etablieren, um Connectase Orthologe mit vorteilhaften Eigenschaften unter bestimmten Bedingungen (z.B. niedrige Temperaturen) zu identifizieren, und um Connectase Orthologe mit sich gegenseitig ausschließenden Erkennungssequenzen zu finden. Solche Varianten erlauben die gleichzeitige Konjugation zweier Substrate mit unterschiedlichen Partnern, beispielsweise mit verschiedenen Fluorophoren. Verglichen mit bekannten Proteinligasen weist Connectase eine weit höhere Substratspezifität auf und katalysiert keine Nebenreaktionen. Sie eignet sich daher um niedrig konzentrierte Moleküle in einer komplexen Lösung zu verknüpfen. Im zweiten Teil des Projekts wollen wir diese Eigenschaft ausnutzen, um Zielproteine per Fluoreszenzmarkierung auf Polyacrylamid-Gelen, auf Microtiterplatten, auf der Zelloberfläche oder im Zytosol nachzuweisen. Bislang beruhen solche Anwendungen hauptsächlich auf der Verwendung markierter (z.B. fluoreszierender) Antikörper, unter anderem solcher, die spezifisch für genetisch eingeführte Erkennungsmerkmale ("tags") in Proteinen sind. Die Verwendung von Connectase ermöglicht ebenfalls die Proteindetektion über ein ähnliches Erkennungsmerkmal (die Erkennungssequenz, s.o.), aber verspricht eine höhere Sensitivität bei weniger Rauschen, verlässlichere Quantifizierungen, schnellere und einfachere Arbeitsabläufe, sowie eine bessere Reproduzierbarkeit.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen