Strukturelle und funktionelle Analyse des ribosomalen Qualitätskontroll-Triggerkomplexes RQT

• Antragsteller: Professor Dr. Roland Beckmann
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 512515806

Die Übersetzung von mRNA in Proteine durch Ribosomen ist ein zentraler Prozess, der Fehlern und Umwelteinflüssen unterliegt. Daher kann sich dieser Prozess verlangsamen oder stoppen, was zu blockierten Ribosomen führt, die mit nachfolgenden Ribosomen kollidieren. Diese ribosomalen Kollisionen werden erkannt, um als Proxy für problematische Translation zu dienen, wodurch Stressreaktionen und Qualitätskontrollwege ausgelöst werden. Ein Schlüsselschritt für die Kollisionsbeseitigung und eine Voraussetzung zum Auslösen der Ribosomen-assoziierten Qualitätskontrolle (RQC) ist die Dissoziation der blockierten Ribosomen in Untereinheiten, die durch den Ribosomen-assoziierten Qualitätskontroll-Triggerkomplex, RQT, ermöglicht wird. Dieser Komplex besteht bei Hefe aus drei und beim Menschen aus bis zu vier Untereinheiten (hRQT/ASC-1-Komplex) mit einer großen Ski2-ähnlichen Helikase Slh1 (ASCC3 beim Menschen). Slh1/ASCC3 enthält zwei ATPase-Kassetten, die die zentrale Helikase-Aktivität für die Dissoziation bereitstellen. Nach Modifikation des Ribosoms mit Ubiquitin wird RQT zu den blockierten Ribosomen rekrutiert. Mit biochemischen Assays und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben wir im Hefesystem beobachtet, dass RQT an die kleine 40S ribosomale Untereinheit bindet und zugängliche mRNA benötigt, um kollidierte Ribosomen zu dissoziieren. Der genaue molekulare Mechanismus der Dissoziation durch RQT, z.B. der Beitrag der einzelnen potentiellen Helikase-Kassetten, ist jedoch unklar. Ebenso unklar ist die Gesamtarchitektur des menschlichen RQT-Komplexes (hRQT), seine Wechselwirkung mit blockierten Ribosomen und seine Funktionsweise bei der Kollisionsdissoziation. Daher schlagen wir vor, den molekularen Mechanismus der RQT-getriebenen Ribosomen-Dissoziation in der Hefe und im menschlichen System zu untersuchen. Es sollen hauptsächlich in vitro Assays eingesetzt werden, um die RNA-Helikase-Aktivität der einzelnen ATPase-Kassetten von Slh1 zu analysieren. Darüber hinaus werden wir Kryo-EM einsetzen, um mRNA-gebundenes RQT direkt am Ribosom zu visualisieren. Im menschlichen System soll das trimere und tetramere hRQT mittels Kryo-EM visualisiert werden, um Einblicke in seine Gesamtarchitektur und mögliche Autoregulationsmerkmale zu gewinnen. Es sollen in vitro Rekonstitutionsassays und in vivo Pullouts unter hRQT-anreichernden Bedingungen verwendet werden, um an kollidierte menschliche Ribosomen gebundenes hRQT zu visualisieren. Insgesamt sollen biochemische und strukturelle Informationen geliefert werden, um die molekularen Mechanismen der Dissoziation kollidierter Ribosomen und die Auslösung von Qualitätskontrollwegen durch RQT/hRQT zu verstehen. Die Ergebnisse können auch für ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen von Krankheiten, die durch ein gestörtes hRQT-System verursacht werden, von Nutzen sein.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen