Spinning-Disk Mikroskop für Lebendzellmikroskopie mit Single Molekül-Lokalisations-Modul

• Fachliche Zuordnung: Grundlagen der Biologie und Medizin
• Förderung: Förderung in 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 514497685

Mittels Fluoreszenzmikroskopie lassen sich die subzelluläre Bewegungen von Proteinkomplexen oder - wenn das Signal hell genug ist - sogar von einzelnen Proteinen verfolgen. Aufgrund der Beugungsgrenze des Lichts ist es nicht möglich, Fluoreszenzsignale aufzulösen, die näher als etwa die halbe Wellenlänge des verwendeten Lichts voneinander entfernt liegen. Die konfokale Mikroskopie hilft, den Kontrast zu verbessern und Signale aus anderen Fokusebenen zu eliminieren, überwindet aber nicht die Beugungsgrenze. Mit diesem Antrag planen wir Spinning-Disk-Mikroskopie als eine hochgradig parallelisierte und daher schnelle Art der konfokalen Bildgebung mit einem Mikroskopmodul zu verküpfen, mit dem wir Einzelmolekül-Lokalisation nutzen, um eine Auflösung nahe der Größe einzelner Moleküle zu erzielen. Mit der Spinning Disk Technologie, planen wir schonendes Live Imaging mit dem bestmöglichen konfokalen Kontrast im Inneren der Zellen, ultimativer Empfindlichkeit und hoher zeitlicher Auflösung in 3D. Anschließend können wir dann an den gleichen Proben die Position der Moleküle zueinander genauer erfassen. So werden sich Fragen zur Lokalisierung von Proteinen und RNS an Organellen oder anderen spezifischen Stellen in der Zelle beantworten lassen. Außerdem wird es uns ermöglichen, die Interaktion zwischen Glioblastomazellen und Neuronen zu analysieren während diese eine exzitatorische Synapse bilden. Hier können wir nicht genau vorhersagen, wann deren Bildung stattfindet, deswegen müssen wir mit hoher Bildrate volumetrische Daten über einen längeren Zeitraum aufnehmen. Daher benötigen wir ein konfokales Spinning-Disk-System, das uns erlaubt, viele Bilder aufzunehmen ohne Phototoxizität oder andere Störungen zu verursachen. Um die beugungsbedingten Auflösungsbeschränkungen zu überwinden, benötigen wir Einzelmolekül-Lokalisierungsmikroskopie (single molecule localisation microscopy, SMLM), um in denselben Proben die genauere Postion der Moleküle zu bestimmen. Das SMLM Modul ermöglicht die Aufnahme von bis zu 3 Kanäle, basierend auf der Kombination von STORM, DNA-paint oder PALM und führt zu einer XY-Auflösung von 20 nm. 3D-Informationen werden durch eine sphärische Linse im Emissionslichtweg gewonnen, und mehrere Mikrometer Probe werden durch die Zusammenführung der in verschiedenen z-Positionen aufgenommenen Superresolution-Stapel dargestellt. Während der höchste Kontrast mit TIRF-Beleuchtung erreicht wird, wollen wir uns auch einige Mikrometer in die Zelle hineinbewegen und benötigen daher eine Möglichkeit, den Einfallswinkel des Lasers automatisch zu verringern, um eine Beleuchtung außerhalb des TIRF-Feldes zu ermöglichen. Wichtig ist, dass alle Komponenten des multimodalen Instruments motorisiert und durch Software gesteuert werden können. Dies ermöglicht die Speicherung benutzerspezifischer Konfigurationen in der Aufnahmesoftware, eine Voraussetzung für den Einsatz des Systems in einer Imaging Facility mit vielen Nutzern, wie hier vorgeschlagen.

• DFG-Verfahren: Forschungsgroßgeräte
• Großgeräte: Spinning-Disk Mikroskop für Lebendzellmikroskopie mit Single Molekül-Lokalisations-Modul
• Gerätegruppe: 5090 Spezialmikroskope
• Antragstellende Institution: Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
• Leiterin: Dr. Ulrike Engel