Expression, Strukturstudien und Protein-Engineering von Lipasen aus Basidiomycota zum besseren Verständnis ihrer sequenz- und strukturgesteuerten Spezifität und ihrer Anwendungen in Käse

• Antragsteller: Dr. Martin Gand, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Lebensmittelchemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 514527182

Bei der Käseherstellung spielt die Bildung bestimmter Aromastoffe und Texturen eine entscheidende Rolle, um ein ansprechendes Produkt zu erhalten. Die Produktion von Aromastoffen während der Käse Herstellung ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem kurz- bis mittelkettige freie Fettsäuren durch Lipolyse erzeugt werden, welche das Aroma von verschiedenen Käsesorten prägen. In früheren Arbeiten konnte ich gezeigt werden, dass Pilze aus dem Phylum Basidiomycota Lipasen produzieren können, mit ähnlicher Kettenlängenspezifität im Vergleich zu tierischen Lipasen, die aus den Zungen von Ziegen, Lämmern und Kälbern oder tierischem Lab ("Pastenlab") der genannten Tiere isoliert werden. Diese Lipasen aus tierischen Quellen sind der derzeitige Stand der Technik in der Käseindustrie zur Herstellung bestimmter Aromastoffe aus Milchfetten. In den letzten Jahren sind jedoch Veränderungen in der Milchindustrie erforderlich geworden, da die Nachfrage nach mikrobiellen und fermentativ gewonnenen Enzymen und Zusatzstoffen als Alternative zu tierischen Produkten steigt. Eine der von mir identifizierten Basidiomyceten-Lipasen hat tendenziell eine leichte Aktivität gegenüber Milchfetten mit langkettigen Fettsäuren. Dieses Projekt beinhaltet die Generierung von Basidiomyceten-Lipase-Varianten durch computergestützte Modellierung, gefolgt von Protein-Engineering im Labor. Die Varianten werden heterolog exprimiert, sowie charakterisiert. Darüber hinaus wird ihre Aktivität, insbesondere im Hinblick auf die Modulation der Kettenlängenspezifität, untersucht und ihre Stabilität für Anwendungen in der Käseproduktion unter Verwendung Kuhmilch experimentell erforscht. Da derzeit keine Kristallstrukturen von Lipasen aus höheren Speisepilzen verfügbar sind, werden die Strukturen mit AlphaFold2 vorhergesagt und anschließend werden die Kristallstrukturen von Varianten gelöst und anschließend für die nächsten Runden des rationalen Designs verwendet. Mit Hilfe der Strukturen der Wildtyp- und Variantenlipasen, die mit der Aufklärung ihrer Spezifität der produzierten freien Fettsäuren und ihrer Stabilitäten abgeglichen werden, wird ein besseres Verständnis der Sequenz und der strukturgeleiteten Spezifität von Lipasen aus Basidiomycota im Allgemeinen gewonnen. Interessant ist auch, dass die eine Lipase, nach Analyse der „lipases engineered database“ v.4 (https://led.biocatnet.de/), in die Familie dieser zur Cholesterinesterase-ähnlichen Enzyme fällt, aber keines der basidiomycetalen Enzyme wurde bisher biochemisch charakterisiert. Weiterhin wurde in unserem Labor keine Cholesterinesterase-Aktivität für dieses Enzym gefunden. Daher ist die Wahrscheinlichkeit einer neuen Untergruppe für Lipasen hoch. Unter diesem Gesichtspunkt sind diese Lipasen aus den Basidiomycota ein interessantes Forschungsziel.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen
• Internationaler Bezug: China
• Kooperationspartnerinnen / Kooperationspartner: Professor Dr. Binglin Li, Ph.D.; Professorin Dr. Fengjiao Xin, Ph.D.