Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der mRNA Freisetzung von Vaccinia-Viren

• Antragstellerinnen: Professorin Dr. Jacomine Krijnse Locker, Ph.D.; Dr.-Ing. Beata Turonova
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Virologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 515013236

Das Pockenvirus Vaccinia-Virus (VACV) wurde als Lebendimpfstoff zur Ausrottung der humanen Pocken eingesetzt. Morphologisch, biochemisch und genetisch ist VACV unter den Pockenviren am umfassendsten untersucht. Mit der Zunahme der Affenpockenfälle in Europa und weltweit, sind Pockenviren wieder in den Blickpunkt des Interesses gerückt. Dieser Antrag konzentriert sich auf den strukturell wenig definierten Prozess der frühen Transkription von VACV, der in vitro aus membranfreien Cores nachgestellt werden kann. Wenn solche Cores mit NTPs inkubiert werden, produziert die virale Transkriptionsmaschinerie, die im Virion verpackt ist, etwa 100 mRNAs. Diese core-assoziierten mRNAs werden anschließend auf bisher ungeklärte Weise aus dem intakten Core freigesetzt. Es wurde postuliert, dass die Cores Poren aufweisen, was aber bis jetzt nicht eindeutig nachgewiesen wurde. Ziel dieses Antrags ist den Freisetzungsmechanismus der mRNAs, sowohl in vitro als auch in situ, zu erforschen. In vitro werden membranfreie Cores, mit Transkriptionsmix inkubiert oder nicht, mittels Kryo-Elektronentomographie (cryoET) und Bildverarbeitung durch Sub-Tomogramm-Mittelung (STA) analysiert. Erste Ergebnisse mit BrUTP, anti-BrU und Negativ-Färbung Elektronenmikroskopie (EM) bestätigen, dass solche Cores transkriptionsfähig sind. Außerdem können unsere vorläufige CryoET und STA Daten, Strukturen im Core darstellen, die bisher nicht analysiert wurden. In situ planen wir mittels kryokorrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (cryoCLEM) die frühe Transkription in infizierten Zellen zu analysieren. Farbtrennung bei einer Infektion mit dreifach markierten Virionen in der Membran, im Core und in der DNA wird zur Identifizierung intrazellulärer Cores mittels Kryolichtmikroskopie gefolgt von CryoCLEM, verwendet. Durch spezifische Hemmung der Transkription oder des Uncoatings werden zytoplasmatische Cores angereichert, die frühe Transkription durchlaufen oder inaktiv bleiben. Diese Cores werden mittels cryoCLEM und anschließender cryoET und STA analysiert. Die frühe Transkription oder ihre Hemmung werden durch parallele LM-Experimente analysiert, indem infizierte Zellen mit Bromouridin oder 5-Ethinyluridin (EU) inkubiert werden, gefolgt von anti-BrU-Markierung oder Click-Labelling. Die Stärke dieses Antrags liegt in der Möglichkeit, in vitro- mit in situ-Daten zu verbinden. Die kombinierten Daten werden zweifellos Aufschluss über den molekularen Mechanismus der Freisetzung von VACV-mRNAs geben. Die Daten werden mit zellulären und viral Strukturen mit ähnlicher RNA-Freisetzungsfunktion verglichen und können die Grundlage für die Entwicklung von Anti-VACV-Wirkstoffen bilden, die die frühe Infektion hemmen. Der cryoCLEM-Arbeitsablauf kann schließlich auch auf andere Virus-Wirt-Systeme in situ angewandt werden, z. B. auf neu auftretende Viren.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen