Molekulare Mechanismen der Erkennung von einzelnen blockierten Ribosomen durch die E3 Ligasen Mag2 and Fap1

• Antragsteller: Professor Dr. Roland Beckmann
• Fachliche Zuordnung: Strukturbiologie ; Biochemie
• Förderung: Förderung seit 2022
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 515291669

Aus verschiedensten Gründen kann sich die Translation von mRNA durch Ribosomen während aller Phasen der Translation verlangsamen oder sogar zum Stillstand kommen. Diese blockierten Ribosomen müssen erkannt werden, um Stressreaktionen hervorzurufen, die die fehlerhaften Translationskomponenten und -produkte abbauen und nachgelagerte Qualitätskontrollwege auslösen. Mehrere biochemische und strukturelle Studien haben gezeigt, dass nachfolgende Ribosomen, die mit dem blockierten Ribosom kollidieren, eine leicht erkennbare Struktur darstellen. Solche ribosomalen Kollisionen erwiesen sich als ein Schlüsselsignal für fehlerhafte Translation in Bakterien und Eukaryoten. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass blockierte initiierende Ribosomen und Ribosomen, die auf mRNAs mit geringer Initiationseffizienz zum Stehen kommen, auch zu solchen Kollisionen führen. Daher bedarf es einer spezifischen Erkennung dieser einzelnen blockierten 80S-Ribosomen. Hier wurde kürzlich gezeigt, dass - ähnlich wie bei der Kollisionserkennung - E3-Ubiquitin-Ligasen wie RNF10 in menschlichen Zellen oder Mag2 und Fap1 in Hefe eine zentrale Rolle bei der Erkennung solcher individuell blockierten Ribosomen spielen. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieser Erkennungs- und Modifikationsaktivitäten sind jedoch nicht bekannt. Daher ist das übergeordnete Ziel dieses Projekts, den molekularen Mechanismus der Initiierung von Qualitätskontrollwegen durch die E3-Ligasen Mag2 und Fap1 aus Hefe und ihre humanen Homologe RNP10 und NFX1 aufzuklären. Insbesondere schlagen wir vor, die folgenden Fragen zu beantworten: Welche Merkmale eines verlangsamten Ribosoms werden von Mag2 erkannt, um eine uS3-Monoubiquitinierung durchzuführen, und was ist die strukturelle Grundlage für die Erkennung und Polyubiquitinierung einzelner 80S-Monosomen durch Fap1 und seine Kofaktoren? Wie werden diese einzelnen blockierten 80S-Ribosomen recycelt? Was ist der Mechanismus der RNF10-gesteuerten Erkennung und Ubiquitinierung von blockierten menschlichen Ribosomen und wie interagiert das Fap1-Homolog NFX1 mit dem menschlichen Ribosom? Wir schlagen vor, mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Strukturen von Mag2-gebundenen und Fap1-interagierenden ribosomalen Komplexen zu lösen, die entweder in vitro rekonstituiert oder aus Hefezellen affinitätsgereinigt werden sollen. Analog schlagen wir Kryo-EM-Strukturanalysen vor, um die Art der Wechselwirkung von RNF10 und NFX1 mit blockierten Ribosomen zu charakterisieren. Dadurch erwarten wir, Einblicke in das dynamische Verhalten dieser Komplexe geben zu können und aufzuklären, wie sie in eukaryontischen Zellen als Sensoren für einzelne blockierte Ribosomen funktionieren. Damit soll ein molekulares Verständnis dieser zentralen und universell konservierten Qualitätskontrollprozesse ermöglicht werden.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen