Zentromerische Transkripte und ihre Funktion für die Entstehung des zentromerischen Chromatins und den Aufbau des Kinetochors

• Antragstellerin: Dr. Inna Lermontova
• Fachliche Zuordnung: Genetik und Genomik der Pflanzen ; Zell- und Entwicklungsbiologie der Pflanzen
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 516520480

Die Chromosomensegregation während der Mitose und Meiose wird durch distinkte Regionen, den sogenannten Zentromeren, kontrolliert. Die Kinetochore, Proteinstrukturen, die sich an den Zentromeren befinden, dienen als Ansatzpunkt für die Spindelmikrotubuli. Das zentromerische Chromatin, das cenH3 enthält, ist durch chromatinbasierte Modifikationen epigenetisch markiert. Die Beladung der Zentromere mit cenH3 wird durch Zentromer-Lizenzierungsfaktoren, cenH3-Chaperone und zentromerische Transkripte reguliert. AtKNL2 spielt als Zentromer-Lizenzierungsfaktor eine wichtige Rolle beim Einbau von cenH3 in die zentromerischen Nukleosomen. Unsere früheren Arbeiten haben gezeigt, dass KNL2 zentromerische DNA und Transkripte binden kann. Darüber hinaus sind die Transkripte in der Lage, mit der DNA um die Interaktion mit KNL2 zu konkurrieren. Die funktionelle Rolle von KNL2 bei der Regulierung von zentromerischen Transkripten wurde jedoch noch nicht im Detail untersucht. Durch Immunpräzipitation, gefolgt von Massenspektrometrie (IP-MS) und einem Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Bibliotheks-Screening von KNL2 konnten wir insgesamt 44 Proteine, die an der Regulierung der zentromerischen Repeats durch den RNAi-Silencing-Mechanismus beteiligt sein könnten, identifizierten. Darunter wurden NRPB2 (RNA-Polymerase II) und EIF4AIII (Spleißfaktor) in beiden Experimenten identifiziert und können somit als mögliche direkte KNL2-Interaktoren angesehen werden, während AGO1, AGO9 und MET1 durch IP-MS mit hoher Wahrscheinlichkeit identifiziert wurden und indirekt mit KNL2 und cenH3 in einem Proteinkomplex verbunden sein können. In dem vorliegenden Projekt wollen wir die Rolle von KNL2 bei der Regulierung der zentromerischen Transkripte und deren Funktion während des Einbaus von cenH3 und der Rekrutierung von Kinetochore-Proteinen an die Zentromere aufklären. Um die Interaktion der ausgewählten Kandidaten mit den zentromerischen Proteinen KNL2 und cenH3 zu validieren, werden BiFC-, Y2H-, FRET- und Co-IP-Ansätze angewendet. Die Proteindynamik der ausgewählten Kandidaten wird durch zellzyklus- und gewebespezifische Lokalisationsanalysen untersucht. Darüber hinaus wird die Verteilung der cen180-Transkripte in A. thaliana und ihr Lokalisierungsmuster im Vergleich zu den identifizierten Kandidaten und bekannten zentromerischen Proteinen (cenH3, KNL2) durch die Immuno-smFISH-Technik ermittelt. Die funktionelle Charakterisierung von nrpb2, eif4a-iii, ago1, ago9 und met1 wird durchgeführt, und es wird im Detail untersucht, wie ihre deregulierte Expression die Stabilisierung der zentromerischen Proteine beeinflusst und den epigenetischen Status der Zentromere verändert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen