Torsionsdynamik von Replikation und Transkription mit Hilfe einer Toolbox von fluoreszierenden DNA-Topologiesensoren

• Antragsteller: Professor Dr. Karl Duderstadt
• Fachliche Zuordnung: Biophysik
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 517791312

Die wichtigste Aufgabe für die Erhaltung und Vermehrung allen zellulären Lebens auf der Erde ist das getreue Abrufen und Vervielfältigen der genomischen Information. Für die Speicherung dieser lebenswichtigen Informationen sind die Zellen auf die DNA angewiesen, die viele Vorteile bietet, darunter die Sequestrierung von Nukleotiden zur Verringerung von Schäden und die zweifache Redundanz zur Erleichterung der Reparatur. Dennoch stellt die doppelhelikale Struktur der DNA eine Herausforderung dar, wenn die informationsreichen DNA-Basen während der Transkription und DNA-Replikation zugänglich gemacht werden müssen. Die Trennung der beiden Stränge führt zu einer Überdrehung und zur Bildung positiver Supercoils, die schnell aufgelöst werden müssen, um extreme Drehmomente zu vermeiden, die wesentliche zelluläre Prozesse stören, zu irreversiblen Chromosomenschäden und letztlich zum Zelltod führen können. Trotz der entscheidenden Bedeutung dieser Ereignisse für das zelluläre Leben haben wir nur sehr begrenzte Kenntnisse über die Dynamik der DNA-Topologie, die beim Zugriff auf genomische Informationen auftritt, da es nur wenige Methoden gibt, die sich für Echtzeitstudien eignen. Daher schlagen wir die Entwicklung einer Toolbox mit fluoreszierenden DNA-Topologiesensoren vor, die Echtzeitstudien der DNA-Topologiedynamik ermöglichen. Um fluoreszierende DNA-Topologiesensoren zu identifizieren und quantitativ zu charakterisieren, werden wir eine Screening-Plattform entwickeln, die eine kalibrierte Sammlung von topologischen Linealen verwendet. Mit Hilfe von Ensemble-Gel-basierten Ansätzen in Kombination mit der Screening-Plattform werden wir Fluorophore und fluoreszenzmarkierte Faktoren mit einzigartigen DNA-Topologie-Erkennungseigenschaften identifizieren. Parallel dazu werden wir, aufbauend auf unseren bisherigen Erfolgen, Einzelmolekül-Fluoreszenz-Imaging-Ansätze entwickeln, um die Transkription und DNA-Replikation bei der Begegnung mit topologischen Herausforderungen in der DNA zu untersuchen. In der letzten Phase des Projekts werden diese Bemühungen mit fluoreszierenden DNA-Topologiesensoren zusammengeführt, die in Transkriptions- und DNA-Replikationsassays eingesetzt werden. Diese Experimente werden zum ersten Mal die Echtzeit-Dynamik der DNA-Topologie während dieser wesentlichen zellulären Prozesse aufzeigen. Diese Beobachtungen werden klären, wie die Torsionsdynamik die Transkriptionsausbrüche reguliert und wie die topologische Energie in der Replikationsgabel verteilt wird, um ein Abwürgen und Zusammenbrechen der Replikationsgabel zu vermeiden. Zusammengenommen werden die von uns entwickelte Sensor-Screening-Plattform und die von uns durchgeführten Echtzeitbeobachtungen als Ressource für alle künftigen Bemühungen zur quantitativen Messung von Veränderungen der DNA-Topologie dienen, um seit langem bestehende Fragen in der Chromosomenbiologie zu beantworten und biotechnologische Anwendungen zu erleichtern.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen