Molekulare Grundlagen der Thermostabilität von Proteinen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die biologische Funktion fast aller Proteine hängt von der geordneten dreidimensionalen Struktur ab, die sie unter physiologischen Bedingungen einnehmen. Verlust dieser Struktur durch Denaturierung führt zu Funktionsverlust und biologischem Abbau. Bei einigen Proteinen kann es auch zur Ausbildung metastabiler Formen unter Ausbildung proteaseresistenter Aggregate (Amyloid) kommen, welche sich in Geweben ablagern und die Kennzeichen degenerativer Erkrankungen von Mensch und Tier sein können. Die Analyse der molekularen Faktoren, welche die native Form von Proteinen stabilisieren, ist daher von großem theoretischen und praktischen Interesse. Die native Struktur eines Proteins stellt ein Energieminimum dar, jedoch ist die entsprechende freie Enthalpie der Stabilisierung in der Regel sehr klein. Diese geringe thermodynamische Stabilität resultiert aus einer Vielzahl einzelner atomarer Wechselwirkungen, die sich im gefalteten Protein teilweise kompensieren. In diesem Projekt sollten insbesondere elektrostatische (Coulomb-) Wechselwirkungen auf der Proteinoberfläche hinsichtlich ihrer Bedeutung für die Stabilisierung der nativen Proteinstruktur untersucht werden. Als Modelle für diese Studie wurden die eng verwandten kleinen Kälteschockproteine Bs-CspB und Bc-Csp verwendet, die sich in ihrer Thermostabilität um fast 30 °C unterscheiden, obwohl ihre Aminosäuresequenzen lediglich an zwölf von insgesamt 67 Positionen abweichen. Durch systematische Mutagenese der Proteine, Analyse ihrer thermodynamischen Stabilität und hoch aufgelöste Kristall Strukturanalysen wurde nachgewiesen, dass lediglich zwei Aminosäureaustausche erforderlich sind, um eine Variante von Bs-CspB zu erzeugen, deren Stabilität der des ßc-Csp entspricht. Umgekehrt lässt sich Bc-Csp durch die reversen Mutationen um den gleichen Betrag destabilisieren. Die Mutationen ändern das Ladungsmuster auf der Proteinoberfläche in charakteristischer Weise: Stabilere Proteinvarianten zeichnen sich durch eine gleichmäßigere Ladungsverteilung aus. Die Studien an den bakteriellen Kälteschockproteinen erlauben den Schluss, dass eine signifikante Stabilisierung von Proteinen durch eine Mutagenese möglich ist, welche die Ladungsverteilung an der Proteinoberfläche optimiert. Dabei scheinen solche Austausche von Aminosäuren besonders geeignet zu sein, die destabilisierende Kontakte zwischen geladenen Seitengruppen im Ausgangsprotein entfernen. Es wird damit ein genereller Weg zur Erzeugung stabilisierter Proteinformen für biotechnologische und pharmakologische Anwendungen aufgezeigt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2000). Thermal stability and atomicresolution crystal structure of the Bacillus caldolyticus cold shock protein. Journal of Molecular Biology 297, 975-988
Mueller, U., Perl, D., Schmid, F.X., Heinemann, U.
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(2000). Two exposed amino acid residues confer thermostability on a cold shock protein. Nature Structural Biology 7, 380-383
Perl, D., Mueller, U., Heinemann, U., Schmid, F.X.
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(2001) Role of the chain termini for the folding transition state of the cold shock protein. Biochemistry 40, 15501-15511
Perl, D., Holtermann, G., Schmid, F.X.
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(2001). Crystal structures of mutant forms of the Bacillus caldolyticus cold shock protein differing in thermal stability. Journal of Molecular Biology 313, 359-369
Delbrück, H., Mueller, U., Perl, D., Schmid, F.X., Heinemann, U.
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(2001). Electrostatic stabilization of a thermophilic cold shock protein. Journal of Molecular Biology 313, 343-357
Perl, D., Schmid, F.X.
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(2002) Some like it hot: The molecular determinants of protein thermostability. ChemBioChem 3, 39-44
Perl, D., Schmid, F.X.
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(2002) The effects of ionic strength on protein stability: The cold shock protein family. Journal of Molecular Biology 319,541-554
Dominy, B.N., Perl, D., Schmid, F.X., Brooks, III, C.L.
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(2002) Thermodynamics of a diffusional protein folding reaction. Biophysical Chemistry 96, 173-190
Perl, D., Jacob, M., Bánó, M., Stupák, M., Antalik, M., Schmid, F.X.
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(2004). Single-stranded DNA bound to bacterial cold-shock proteins: Preliminary crystallographic and Raman analysis. Acta Crystallographica D 60, 755-757
Bienert, R., Zeeb, M., Dostál, L., Feske, A., Magg, C., Max, K., Welfle, H., Balbach, J., Heinemann, U.
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(2006). T-rich DNA single strands bind to a preformed site on the bacterial cold shock protein Bs-CspB. Journal of Molecular Biology 360, 702-714
Max, K.E.A., Zeeb, M., Bienert, R., Balbach, J., Heinemann, U.
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(2007). Common mode of DNA binding to cold shock domains: Crystal structure of hexathymidine bound to a domain-swapped form of the major cold shock protein of Bacillus caldolyticus. FEBS Journal 274,1265-1279
Max, K.E.A., Zeeb, M., Bienert, R., Balbach, J., Heinemann, U.
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(2007). Optimized variants of the cold shock protein from in vitro selection: Structural basis of their high thermostability. Journal of Molecular Biology 369,, 1087-1097
Max, K.E.A., Wunderlich, M., Roske, Y., Schmid, F.X., Heinemann, U.
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(2007). Sequence specificity of singlestranded DNA-binding proteins: A novel DNA microarray approach. Nucleic Acids Research 35: e 75, 1-7
Morgan, H.P., Estibeiro, P., Wear, M.A., Max, K.E.A., Heinemann, U., Cubeddu, L., Gallagher, M.P., Sadler, P.J., Walkinshaw, M.D.
