Raumzeitliche Analyse der Zusammensetzung β-arrestin gestützter "Signalosome" – die Bedeutung spezifischer Effektorbindung für die funktionale Selektivität des protease-activated receptor 2.
Strukturbiologie
Zellbiologie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Projekt wurde konzipiert, um die Rolle von β-arrestinen in der durch den Protease-aktivierten Rezeptor 2 (PAR2) initiierten Schmerzsignaltransduktion weiter zu untersuchen. Als G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) ist PAR2 Teil der größten Membranprotein Familie, welche einen Großteil physiologischer Prozesse beeinflusst und koordiniert. Die meisten der 800 verschiedenen GPCRs übermitteln ihre Signale über dutzende Kombinationen von Gα und Gβγ Untereinheiten, die sich zu den erforderlichen G Proteinen zusammensetzen. Andererseits existieren nur zwei ubiquitär exprimierte Arrestin Isoformen (β-arrestin1 und 2) und vier GPCR Kinasen (GRK2, 3, 5 und 6), welche die Desensibilisierung, Internalisierung, den intrazellulären Transport und spezialisierte Signalantworten für alle GPCRs vermitteln. Um zu verstehen, wie Arrestine und GRKs im Verbund gezielte und vielfältige Funktionen für so viele verschiedene Rezeptoren ermöglichen und um ihre spezifischen Rollen bei der Initiierung PAR2-mediierter Schmerzsignale zu erforschen, wurden alle erforderlichen Expressionsvektoren konstruiert um die GRK-spezifische β-arrestin-Assoziation mit PAR2 zu bestimmen. Unter Verwendung zweier verschiedener Aktivierungsmechanismen des Rezeptors zeigen die Resultate, dass der endogene Aktivator, Trypsin, ein auffallend anderes kinetisches Aktivierungsprofil im Vergleich zum optimierten Peptidliganden 2f-LIGRLO-NH2 (2F) aufweist. Anhand eines zuvor beschriebenen Testsystems, bestehend aus verschiedenen GRK-Knockout-Zelllinien, bestätigen die Ergebnisse weiterhin, dass alle vier ubiquitär exprimierten GRK Isoformen individuell in der Lage sind, die Arrestin-Rekrutierung zu PAR2 zu begünstigen. Darüber hinaus zeigen die Experimente, dass die Überexpression jeder GRK Isoform eine Rezeptor-β-arrestin-Bindung, unabhängig von der Zugabe eines Aktivators, vermittelt. Schließlich wurden spezialisierte Biosensor-Messsysteme etabliert, um PAR2-induzierte β-arrestin Konformationsänderungen zu untersuchen. Diese Messungen werden bestätigen, ob β-arrestine eine Konformation annehmen, die spezifisch die Initiierung von Schmerzsignalen unterstützt. Die ersten Ergebnisse zeigen hier, dass β-arrestin2 ähnliche Konformationsänderungen bei der Rekrutierung durch trypsin und 2F aktivierte PAR2 Rezeptoren durchläuft, welche sich jedoch in gewissen Positionen signifikant unterscheiden. Letztlich war das Ziel dieses Projekts, die molekulare Grundlage von Schmerz bei akuter und chronischer Entzündung zu erforschen. Als einer der Hauptvermittler von entzündlichem Schmerz, hat sich PAR2 bereits als ein vielversprechendes Arzneimittelziel etabliert, welches jedoch noch nicht klinisch genutzt wird. Dieses Projekt wird durch Mittel der University of Nottingham fortgesetzt, um subzelluläre Komplexkonfigurationen zwischen PAR2, βarrestinen und essentiellen Effektorproteinen zu charakterisieren. Die generierten Ergebnisse erweiterten bereits jetzt unser Verständnis subzellulärer GPCR-Signale und sollen eine neuartige Arzneimittelentdeckung ermöglichen, um GPCR-Signalantworten in subzellulären Kompartimenten zu modulieren (räumlich-selektive Funktionalität).
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Conformational flexibility of β‐arrestins – How these scaffolding proteins guide and transform the functionality of GPCRs. BioEssays, 45(8).
Haider, Raphael S.; Reichel, Mona; Matthees, Edda S. F. & Hoffmann, Carsten
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Arrestin‐centred interactions at the membrane and their conformational determinants. British Journal of Pharmacology, 182(14), 3135-3150.
Underwood, Owen; Haider, Raphael Silvanus; Sanchez, Julie & Canals, Meritxell
