Analysen zur Bedeutung des Talin1/Paxillin/Kindlin3-Komplexes für die Regulation der Integrin-Funktion in hämatopoetischen Zellen und Mäusen

• Antragsteller: Privatdozent Dr. Markus Moser
• Fachliche Zuordnung: Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 520308008

Integrine sind eine Familie von nahezu ubiquitär exprimierten Zelladhäsionsrezeptoren. Integrine benötigen einen Aktivierungsschritt gefolgt von einer Organisation in komplexe Adhäsionsstrukturen um fest in ihre Liganden zu binden. Die Bindung von Talin und Kindlin an die zytoplasmatische Domäne von Integrinen ist essentiell für beide Prozesse und der Verlust eines der beiden Regulatoren führt bereits zu deren vollständigen Funktionsverlust. Während die molekularen Prozesse der Talin-induzierten Aktivierung von Integrinen gut charakterisiert sind, ist die Funktion von Kindlin hierbei weit weniger gut verstanden. Insbesondere die Frage wie beide Proteine bei der Regulation der Integrin Aktivität kooperieren, blieb bislang unbeantwortet. Wir konnten vor kurzem in umfassenden Struktur und in vitro Analysen zeigen, dass Talin indirekt über das Adapterprotein Paxillin an Kindlin bindet. Wir verfolgen die Hypothese, dass dieser Talin/Paxillin/Kindlin Komplex aktive Integrine in Micro-Cluster zusammenfasst, die eine unmittelbare feste Bindung an multivalente Liganden ermöglicht. In dem hier vorliegenden Antrag wollen wir die Bedeutung der Talin-Paxillin und Paxillin-Kindlin Interaktion in physiologischen Zellkultursystemen und in vivo untersuchen, und fokussieren uns dabei auf die Regulation von Leukozyten Integrinen, da diese Zellen auf eine schnelle Bildung stabiler Adhäsionen angewiesen sind. Dazu verwenden wir genetisch manipulierte Hoxb8 Vorläuferzelllinien, die in der Lage sind in vitro in Neutrophilen-ähnliche Zellen und Makrophagen zu differenzieren, die primären Zellen funktionell sehr nahekommen. Mithilfe von CRISPR/Cas9/12-vermitteltem Gene Editing haben wir Hoxb8-Zellklone erzeugt, die Mutationen in den Paxillin-Bindungsstellen der endogenen Talin1 und Kindlin3 Proteine tragen. Unsere vorläufigen Untersuchungen zeigen, dass ein Verlust der Talin-Paxillin Interaktion die Integrin-vermittelte Adhäsion von Neutrophilen-ähnlichen Zellen unter statischen und Fluß-Bedingungen deutlich reduziert. In umfassenden zellbiologischen und biochemischen Studien werden wir die Bedeutung des Talin/Paxillin/Kindlin3-Komplexes bei der Regulierung von Leukozyten Integrinen untersuchen. Insbesondere wollen wir seine Rolle bei der Leukozytenadhäsion und der Signaltransduktion, der Integrinaktivierung und der Bildung von Mikro-Clustern, gefolgt vom Aufbau komplexer Adhäsionsstrukturen, sowie seine Auswirkungen auf die Zellmigration analysieren. Zudem wollen wir mit biochemischen Methoden und mittels Massenspektrometrie mechanistische Erkenntnisse über die Initiierung, Bildung und Regulation des Talin/Paxillin/Kindlin3-Komplexes während der Leukozytenadhäsionskaskade gewinnen. Darüber hinaus ist es uns bereits gelungen, Talin1-Mausmutanten mit einer mutierten Paxillin-Bindungsstelle zu erzeugen. Mit diesen Tieren werden wir die verschiedenen Schritte der Leukozytenadhäsionskaskade ex vivo und in vivo unter homöostatischen und entzündlichen Bedingungen untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen