Molekulare Mechanismen der Enhancer-Promotor Kommunikation während der Entwicklung

• Antragsteller: Dr. Arnaud Krebs, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 522185250

Die Bindung von Transkriptionsfaktoren (TFs) an Enhancer ist ein entscheidender Schritt für die Aktivierung von Genen, die für den Erwerb der Zellidentität während der Entwicklung erforderlich sind. Enhancer sind oft mehrere Megabasen von dem Gen entfernt, das sie regulieren. Daher erfordert die Aktivierung der meisten Entwicklungsgene eine weitreichende Interaktion zwischen ihnen und ihrem Zielpromotor. Die Mechanismen, durch die die Bindung von TFs an Enhancern zur Bildung von Enhancer-Promoter-Kontakten und zur späteren Aktivierung der Transkription beiträgt, sind jedoch kaum bekannt. Stimuliert die Bindung von TFs an Enhancern die Rekrutierung von TFs an Promotoren? Ist diese koordinierte Rekrutierung für die Bildung von E-P-Kontakten erforderlich? Ist eine koordinierte TF-Bindung an E-P-Paaren für die Rekrutierung von RNA Pol II und die Aktivierung der Transkription erforderlich? Um diese Fragen zu beantworten, werden wir eine Technologie entwickeln, mit der die Genombesetzung von TFs an Enhancern und Promotoren gleichzeitig nachgewiesen werden kann. Wir werden DNA-Footprinting von TFs durch Methyl-Transferasen mit der Sequenzierung langer DNA-Moleküle kombinieren, um kontinuierliche DNA-Besetzungen über 15 kb zu kartieren. Wir werden dieses Experiment in zwei Paradigmen der Genaktivierung durchführen: 1) Hormoninduktion der Genaktivierung 2) in zwei Entwicklungsstadien von Drosophila-Larven, einem bewährten Modell für die Untersuchung von Genregulationsmechanismen. In Drosophila befinden sich die meisten Enhancer innerhalb von 7 Kilobasen von ihrem Zielpromotor. So können wir untersuchen, ob die Bindung bestimmter TFs an Enhancern zu Veränderungen in der TF-Bindung und Transkriptionsaktivierung an Promotoren führt. Unsere Daten werden die koordinierte TF-Bindung zwischen weit entfernten regulatorischen Elementen aufzeigen, was auf ihre Beteiligung an der Kommunikation von Aktivierungssignalen an Promotoren hinweisen könnte. Viele der Gene, die in späten Entwicklungsstadien exprimiert werden, bilden bereits Stunden vor der Aktivierung der Transkription E-P-Kontakte. Wir werden diese zeitliche Trennung nutzen, um zu fragen, ob die zwischen entfernten Stellen beobachtete gleichzeitige TF-Besetzung eher an der E-P-Bildung oder der Transkriptionsaktivierung beteiligt ist. Um über korrelative Beweise hinauszugehen, werden wir die TF-Bindung an diesen Stellen in cis und trans stören. Wir werden den schnellen Abbau der TFs mit Optogenetik und ortsspezifischer Mutagenese mit CRISPR-Cas9 kombinieren und die Folgen für die Bildung von E-P-Kontakten und die Transkriptionsaktivierung untersuchen. Diese Daten werden zeigen, ob spezifische TFs für E-P-Kontakten eine Rolle spielen. Außerdem soll festgestellt werden, ob die gleichzeitige Bindung bestimmter TF-Kombinationen an E-P-Paaren die Transkription aktiviert.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen