Ontogenetische Variationen im Proteinrepertoire auditorischer Hirnstammareale von Ratten: eine quantitative Proteomanalyse
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Während der Ontogenese neuraler Strukturen kommt es zu teils massiven Änderungen in deren Proteinrepertoire. Den im jungen Gehirn differentiell vorkommenden Proteinen kommt eine besondere Funktion bei der Reifung der neuronalen Schaltkreise zu, wohingegen im adulten Tier differentiell vorkommende Proteine für die spezifischen Anforderungen des neuralen Systems notwendig sind, im auditorischen Hirnstamm etwa für die zeitliche Informationsverarbeitung. Folglich werden Proteine in der Ontogenese rauf‐ wie runterreguliert. Im Mittelpunkt dieses Projektes stand die quantitative Analyse von entwicklungsabhängigen Veränderungen im Proteom von zwei auditorischen Hirnstammarealen, dem Superioren Olivenkomplex (SOC) und dem Colliculus inferior (IC). Dazu wurden bei Ratten Gewebsproben im neonatalen Alter (Postnataltag P4) mit Gewebsproben des ausgereiften Gehirns (P60) verglichen. Im SOC wurde die cytosolische Protein‐Fraktion mittels differentieller Gelelektrophorese (2‐D DIGE) und Massenspektrometrie untersucht, und im IC wurde zusätzlich und komplementär dazu auch eine Plasmamembran‐angereicherte Protein‐Fraktion nach isobarer Markierung (iTRAQ) massenspektrometrisch analysiert. Die iTRAQ‐Analyse ergab quantitative Unterschiede bei 34% der quantifizierten IC‐Proteine (32 von 94). Mittels DIGE wurden sowohl im SOC als auch im IC 12% der insgesamt 1.276 Proteinspots signifikant als altersabhängig reguliert erkannt (102 von 879 bzw. 49 von 397). Daraus konnten 63 Proteine im SOC und 27 Proteine im IC identifiziert werden, von denen 18 überlappten. Obwohl sich die in der KEGG‐Datenbank verzeichneten Pfade (z.B. Cellular Processes) bezüglich ontogenetischer Veränderungen zwischen beiden auditorischen Arealen ähnelten, waren auf Ebene individueller Proteine nur 18% (13 von 71) sowohl im SOC als auch im IC verändert, dagegen zeigten 75% (53 von 71) eine Regulation in nur einem der beiden Areale und (5 von 71) entgegengesetzte Änderungen. Dies lässt auf deutlich unterschiedliche Entwicklungscharakteristiken zwischen SOC und IC schließen. Für einige der differentiell exprimierten Proteine wurden die massenspektrometrischen Ergebnisse in Western blots und/oder per Immunhistochemie validiert, z.B. für Stathmin, von dem man weiß, dass es dynamische Prozesse am Cytoskelett erleichtert. Dieses Protein war in unseren SOC‐DIGE Analysen als stark runterreguliert erkannt worden, mit einbem regulationsfaktor von > 8 zwischen P4 und P60. Unsere Validierungsexperimente bestätigten diese altersabhängige Abnahme und zeigten, dass Stathmin vor allem mit Axonen und dem Neuropil assoziiert ist. Die hohen Stathmin‐Level im P4‐SOC korrelieren mit der Periode des Neuritenwachstums und der Synapsenreifung und stehen reziprok zur Zunahme der Abundanz von Proteinen der extrazellulären Matrix. Stathmin und die Proteine der extrazellulären Matrix scheinen folglich antagonistisch zu wirken und die Periode der neuronalen Plastizität zu erhalten bzw. zu limitieren. Wie zu erwarten und bereits im Antrag erläutert, konnten physiologische Untersuchungen mit dem Ziel, die Funktion der entwicklungsrelevanten Proteine im auditorischen Hirnstamm zu untersuchen, im Rahmen dieses Projekts nicht mehr durchgeführt werden. Zusammenfassend sind in diesem Projekt etliche interessante, altersabhängig regulierte Proteine identifiziert und erstmals mit der Entwicklung der Hörbahn verknüpft worden (71 für SOC und IC per DIGE, 32 für IC per iTRAQ). Neben der ontogenetischen Analyse wurden im Rahmen dieses Projekts noch zwei weitere Aspekte behandelt. Zum einen haben wir eine Färbemethode entwickelt, mit der man bei Western blots die aufgetragene Proteinmenge bestimmen und die bei Kalibrierung auf ‚housekeeping proteins‘ auftretenden Probleme vermeiden kann. Zum anderen haben wir in adulten Ratten eine vergleichende Proteinstudie durchgeführt, um Areal‐spezifische Unterschiede zwischen drei auditorischen Hirnstammregionen (SOC, IC und Nucleus cochlearis) zu detektieren und zu charakterisieren.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2013) Developmental changes of the protein repertoire in the rat auditory brainstem: A comparative proteomics approach in the superior olivary complex and the inferior colliculus with DIGE and iTRAQ. J Proteomics 79:43‐59
Kaltwaßer B, Schulenborg T, Beck F, Klotz M, Schäfer KH, Schmitt M, Sickmann A, Friauf E
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(2014) Epicocconone staining: a powerful loading control for Western blots. Proteomics 14:162‐168
Moritz C, Marz SX, Reiss R, Schulenborg T, Friauf E
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Neuroproteomics in the auditory brainstem: candidate proteins for ultrafast and precise information processing. Molecular and Cellular Neuroscience, Volume 64, January 2015, Pages 9-23
Christian P. Moritz, Eugenia Eckstein, Stefan Tenzer, Eckhard Friauf
