Die Rolle von Guanin-Quadruplexen bei der Zelltyp-spezifischen, transkriptionellen und post-transkriptionellen Regulation der Schilddrüsenhormonrezeptoren TRalpha1 und TRalpha2

• Antragsteller: Dr. Georg Sebastian Hönes
• Fachliche Zuordnung: Endokrinologie, Diabetologie, Metabolismus
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 525051195

Schilddrüsenhormone (thyroid hormones, TH) sind für die normale Entwicklung, das Wachstum und die Regulierung wichtiger Körperfunktionen zwingend erforderlich. Sie wirken als Liganden der Schilddrüsenhormonrezeptoren (thyroid hormone receptors, TRs) alpha (TRa) und beta. Das Gen THRA kodiert u.a. für zwei Rezeptorisoformen TRa1 und TRa2, wobei TRa2 durch alternatives Spleißen gebildet wird und kein TH binden kann. Dies wirkt der TRa1 Wirkung entgegen. Folglich bestimmt das Vorhandensein der jeweiligen Rezeptorisoform, wie eine Zelle oder ein Organ auf TH reagiert. Welche Faktoren die Expression von TRa1 und TRa2 steuern, ist selbst 35 Jahre nach der Entdeckung der Rezeptoren weitestgehend unbekannt. Wir vermuten, dass hier Guanin-Quadruplexe (G4) eine entscheidende Rolle spielen. G4s sind wichtige regulatorische Elemente der Genexpression, die sowohl von DNA als auch von RNA gebildet werden. In Promotoren steuern sie die Transkription eines Gens, in 5’UTRs vieler mRNAs blockieren G4s die Proteinbiosynthese und auch eine Regulation des alternativen Spleißens ist bekannt. In unserem Projekt wollen wir daher die Rolle von G4s bei der organspezifischen Expression von TRa1 und TRa2 untersuchen. In einer Analyse von THRA konnten wir zwei G4s im Promotor, ein RNA-G4 in der 5’UTR und fünf RNA-G4-bildende Sequenzen von Exon 9 bis Exon 10 (wichtig für das alternative Spleißen von TRa1 und TRa2) identifizieren, wodurch sich drei voneinander unabhängige Teilprojekte ergeben:1. Bestimmung der Rolle und Funktion der DNA-G4s im Promotor von THRA.2. Einfluss des RNA-G4 in der 5’UTR von TRa auf die Proteinbiosynthese.3. Charakterisierung der physiologischen Relevanz der RNA-G4s beim alternativen Spleißen von TRa. Mittels FRET (Förster-Resonanz-Energie-Transfer) und CD-Spektroskopie ermitteln wir die Struktur der G4s sowie auch die minimale Anzahl an Mutationen, welche eine Bildung der G4s verhindert. Durch den Einsatz von zellbasierten Reporter-Assays (Dual-Luciferase Assay, dichromatischer Spleiß-Reporter Assay) soll die Funktionalität der einzelnen G4-Kanditaten getestet und gegen mutierte Varianten verglichen werden. Durch Genom-Editierung (CRISPR/Cas) wird eine FLAG-Tag Reporter-Zelllinie generiert, die es uns ermöglicht die gewonnen Ergebnisse auf die physiologische Expression von TRa1 und TRa2 zu untersuchen. Die G4-bildenden Sequenzen kommen in allen Zelltypen vor. Um also die Frage nach der Organ- bzw. Zellspezifität zu klären, werden aus verschiedenen Organen, zellspezifische G4-bindende Proteine mittels Pull-Down Assays mit anschließender massenspektrometrischer (timsTOF) Analyse identifiziert. Abschließend soll die Wirkung der Bindungspartner durch Überexpression bzw. Gen-Silencing (RNA Interferenz) in der Reporter-Zelllinie untersucht werden. Dieses Projekt wird das Wissen über die der Expression von TRa1 und TRa2 zugrundeliegenden regulatorischen Mechanismen erweitern und somit einen Beitrag zum besseren Verständnis der lokalen TH-Wirkung leisten.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen