Optogenetische Ansätze zur Untersuchung der Thrombozytenproduktion und -funktion

• Antragsteller: Professor Dr. Markus Bender; Dr. Shiqiang Gao, Ph.D.
• Fachliche Zuordnung: Hämatologie, Onkologie ; Anatomie und Physiologie ; Zellbiologie
• Förderung: Förderung seit 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 525167920

Die molekularen Mechanismen, die die Megakaryozyten (MK) Differenzierung und Polarisierung, sowie die Thrombozytenproduktion regulieren, sind nur unzureichend bekannt. Ca2+, cAMP und cGMP spielen eine wichtige Rolle in MKs, jedoch sind die mechanistischen Details wenig verstanden. Wir haben die Hypothese, dass ihre modulatorischen Wirkungen in räumlicher und zeitlicher Hinsicht dynamisch variieren, was mit herkömmlichen Methoden, außer der Optogenetik, nicht leicht zu analysieren ist. Bei der Optogenetik kann man mithilfe von Licht molekulare Ereignisse in lebenden Zellen oder Organismen präzise modulieren. In Vorarbeiten haben wir optogenetische Konstrukte in primären MKs exprimiert, die es uns ermöglichten, mit Licht die Rolle des Ioneneinstroms und der zyklischen Nukleotide in MKs in vitro zu untersuchen. Ein weit verbreitetes, optogenetisches Konstrukt ist Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein durch blaues Licht aktivierbarer, nicht-selektiver Kationenkanal aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Um den Einfluss von Veränderungen des intrazellulären Ca2+-Spiegels auf die MK Funktion besser zu verstehen, haben wir die modifizierte Variante ChR2 XXM2.0 generiert, welche eine erhöhte Ca2+-Permeabilität aufweist. Wir haben ChR2 XXM2.0 nach viraler Infektion in MKs exprimiert und den Ca2+-Einstrom mit Licht räumlich und zeitlich manipuliert. Die lokale Beleuchtung von auf Fibrinogen adhärenten ChR2 XXM2.0 exprimierenden MKs löste eine verstärkte Stressfaserbildung, Zellpolarisation sowie Motilität in Richtung des Lichts aus, welche abhängig von der Cdc42- und Myosin IIA-Aktivität war. In einem anderen Ansatz wiesen MKs, die die photoaktivierte Adenylylzyklase (bPAC) oder photoaktivierte Guanylylzyklase (BeCyclop) exprimierten, nach der Beleuchtung signifikant erhöhte cAMP- bzw. cGMP-Spiegel auf. Wir identifizierten Phosphodiesterase (PDE) 5 als die prädominante cGMP-Spiegel regulierende PDE in MKs. Auf Grundlage unserer Vordaten haben wir optogenetische ChR2 XXM2.0 und BeCyclop transgene Mäuse generiert, um nun die MK Funktion in vivo sowie die Thrombozytenfunktion in vitro und in vivo durch Licht manipulieren zu können. Um die subzelluläre Rolle der kleinen GTPase Cdc42, die an der lichtinduzierten, durch Ca2+-Signale vermittelten MK Polarisierung beteiligt ist, zu untersuchen, beabsichtigen wir die lokale Cdc42 Aktivität direkt durch Licht zu steuern. Dies kann durch die Herstellung eines lichtinduzierbaren Werkzeugs zur Steuerung der Lokalisierung von Zielproteinen in MKs erreicht werden. Wir wollen dies auch auf andere Proteine ausweiten, um die MK Differenzierung und die Thrombozytenproduktion mit Hilfe von Licht präzise zu kontrollieren und manipulieren, und dadurch Schlüsselproteine und -mechanismen zu identifizieren. Insgesamt haben wir zum ersten Mal die Optogenetik in MKs etabliert und wollen nun die dynamische Rolle von Ca2+, cAMP/cGMP und Proteinen wie kleinen GTPasen sowohl in MKs als auch in Thrombozyten genauer untersuchen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen